一种藏猪ROBO4基因上游调控区SNP标记、其表达特征及其在评价低氧适应性中的应用

本发明属于动物分子生物学与遗传育种，具体涉及一种位于roundaboutguidance receptor 4 (robo4) 基因上游调控区的单核苷酸多态性（snp）标记，同时涉及藏猪与该snp相关的robo4基因心脏特异性高表达特征，以及其在评估和筛选动物低氧适应性中的应用。

背景技术：

1、猪对低氧环境的适应是一个复杂的生理过程，涉及氧气运输、血管生成、能量代谢等多个生物学通路。传统的选育方法主要依赖于表型选择，例如通过观察猪在高原环境下的存活率、生长速度或测定其血氧饱和度、红细胞压积等生理指标来进行筛选。然而，这些表型性状易受环境、营养、年龄等多种因素影响，准确性不高，且测定周期长、成本高，无法在个体早期（如仔猪阶段）进行有效选择，严重阻碍了高原适应性猪种的遗传改良进程。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择（mas）为动物育种提供了新的思路。通过寻找与目标性状紧密关联的dna分子标记，可以在个体出生后甚至胚胎期就对其遗传潜力进行精准评估，从而大大提高选育效率和准确性。robo4（roundabout guidance receptor 4）基因在维持血管稳态和促进血管新生中发挥关键作用，是机体应对低氧环境的重要调控因子。藏猪作为青藏高原的特有猪种，其心血管系统对低氧环境具有卓越的适应能力。前期研究发现，robo4基因在藏猪心脏组织中的表达量显著高于普通白猪，但导致这一表达差异的顺式调控机制尚不明确。因此，发掘能够解释robo4基因表达差异的功能性遗传变异，对于解析藏猪低氧适应性的分子机制及开展分子育种具有重要意义。然而，截至目前，尚未有关于robo4基因的特定位点与猪低氧适应性状显著关联的报道，更缺乏基于该基因的分子标记用于高原猪种选育的技术方案。因此，挖掘robo4基因上与猪低氧适应性状相关的功能性snp位点，并开发相应的分子检测技术，对于培育耐低氧、抗逆性强的新品种（系）具有重要的理论意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种藏猪robo4基因上游的特异性snp标记，并揭示其在藏猪心脏组织中的独特表达特征。

2、一种与猪低氧适应相关的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq idno.1所示，其中第251位……ggggct/cccgaat……呈现t/c突变。

3、所述snp分子标记中与robo4基因相关的突变位点：g.52308138t>c；

4、所述g.52308138t>c位于所述snp分子标记在参考基因组正链上的物理坐标为52308138，表现为t/c多态性（g.52308138t>c），所述位点基因型为tt、tc或cc，其中cc基因型猪的robo4表达量显著高于tt基因型；

5、所述snp分子标记在距离robo4基因起始密码子atg上游1468bp处。

6、本发明还提供了上述的与猪低氧适应相关的snp分子标记的应用，所述snp分子标记用于鉴定猪低氧适应，该鉴定方法为：

7、s1、提取待检测猪的基因组dna；

8、s2、对s1中所述待检测猪的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物；

9、所述pcr扩增的反应体系为：2×taq pcr master mix 10μl、待检测猪的基因组dna 1μl、正向引物0.6μl、反向引物0.6μl、ddh2o 7.8μl；

10、所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性15min；进行40个循环：95℃预变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸5min；

11、所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；

12、s3、对s2中得到的pcr产物进行测序，用chromas pro软件将测序文件与如seq idno.1所示的snp分子标记的核苷酸序列进行比对分析，根据序列g.52308138t>c处判断待检测基因型；

13、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

1.一种与猪低氧适应性相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记位于猪robo4基因上游调控区，在参考基因组正链第52308138位存在t/c多态性，即g.52308138t>c，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记的突变位点为g.52308138t>c.。

3.根据权利要求1或2所述的snp分子标记，其特征在于，g.52308138t>c位于参考基因组（sus scrofa，nc_139391.1）正链第52308138位，表现为t/c多态性，且位于robo4基因起始密码子atg上游1468 bp处；所述位点的基因型为tt、tc或cc，其中cc基因型猪的robo4表达量显著高于tt基因型。

4.一种检测权利要求1-3任一项所述snp分子标记的引物对，其特征在于，正向引物如seq id no:2所示，反向引物如seq id no:3所示

5.一种如权利要求1-3任一项所述的snp分子标记在猪低氧适应性评价、种质筛选及分子标记辅助育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过检测猪robo4基因g.52308138t>c位点的基因型，筛选耐低氧猪种质；其中，cc基因型个体为耐低氧优势个体，tt基因型个体为低氧敏感个体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述耐低氧猪种质筛选的具体方法包括以下步骤：

8.一种如权利要求4所述的引物对在检测猪低氧适应性、辅助耐低氧猪育种中的应用。

9.根据权利要求5或8所述的应用，其特征在于，所述猪为高原藏猪、平原养殖猪任一猪种，适用于仔猪早期种质筛查、成猪种质鉴定及新品种耐低氧品系培育场景。