一种与大豆二粒荚大小相关的KASP分子标记、引物及其应用

本发明属于大豆分子育种，更具体地，涉及一种与大豆二粒荚大小相关的kasp分子标记、引物及其应用。

背景技术：

1、鲜食大豆又称菜用大豆，凭借口感清甜、营养丰富、食用便捷等优势，成为广受市场青睐的特色经济作物。二粒荚是鲜食大豆的主要商品荚类型，其荚长和荚宽等外观品质性状影响大豆鲜荚的商品外观、市场等级及经济价值，因此培育大荚型、优质鲜食大豆品种是当前鲜食大豆育种的核心目标之一。

2、传统大豆二粒荚大小性状的筛选鉴定主要依赖田间成熟期表型人工测量，存在诸多技术缺陷：一是育种周期长，需待大豆鼓粒成熟期方可开展性状鉴定，无法实现早期筛选；二是检测效率低、人工成本高，难以适配大批量种质资源筛选；三是表型性状极易受温度、光照、水肥等环境因素干扰，鉴定结果稳定性差、准确率低，严重制约大荚型鲜食大豆的育种进程。

3、kasp（竞争性等位基因特异性pcr）分子标记技术是基于snp位点的高通量基因分型技术，具有分型精准、稳定性高、成本低廉、不受环境干扰的优势，是作物分子标记辅助育种的核心技术手段。目前，针对鲜食大豆二粒荚大小性状，已报道的稳定关联snp位点及可直接用于育种选择的kasp分子标记仍较少，限制了该性状的精准分子辅助育种应用。因此，发掘大豆二粒荚大小关键snp位点、开发专属kasp分子标记并建立标准化育种应用体系，是突破现有大荚型大豆育种技术瓶颈的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种与大豆二粒荚大小相关的kasp分子标记、引物及其应用，以解决上述技术问题。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了大豆二粒荚大小相关的kasp分子标记s02_5725405，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述核苷酸序列第200位的碱基为snp位点，多态性为c或t，所述snp位点为tt基因型的大豆二粒荚的荚长和荚宽大于该位点为cc和ct基因型的大豆二粒荚。

4、本发明首次通过全基因组关联分析在大豆2号染色体5725405bp处鉴定到一个与二粒荚荚长和荚宽极显著关联的snp位点s02_5725405，明确t等位基因为大荚型优异基因型；在此基础上，基于该snp的c/t碱基变异开发kasp特异性引物组，下游引物5′端分别连接fam和hex荧光标签，通过荧光信号聚类实现cc和tt基因型的精准分型，分型准确率达100%；种质验证表明tt基因型大豆的二粒荚平均荚长（8.701cm）和荚宽（2.066cm）极显著大于cc基因型。本发明打通了二粒荚大小性状的分子标记辅助育种应用通道，可在前期实现大荚型的早期筛选，为鲜食大豆大荚型优异品种的选育与种质改良提供了高效、稳定、低成本的技术工具。

5、本发明还提供一种扩增所述分子标记的特异性引物，所述引物包括如seq idno.2所示的上游通用引物，如seq id no.3和seq id no.4所示的下游等位基因特异性引物。

6、本发明还提供一种检测大豆二粒荚大小的试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物。

7、进一步的，所述试剂盒还包括2×kasp master mix。

8、本发明还提供所述分子标记、所述特异性引物或所述试剂盒在鉴定大豆二粒荚大小中的应用。

9、本发明还提供所述分子标记、所述特异性引物或所述试剂盒在大豆育种或辅助大豆育种中的应用，其特征在于，所述辅助大豆育种是培养大荚型的大豆。

10、本发明还提供一种鉴定大豆二粒荚大小的方法，包括以下步骤：

11、（1）提取待测大豆的基因组dna；

12、（2）以提取的dna为模板，利用所述的特异性引物进行扩增，得到扩增产物；

13、（3）鉴别所述扩增产物对应snp位点的基因型，根据基因型判断待测大豆的二粒荚大小。

14、本发明还提供一种鉴定大豆二粒荚大小的方法，所述判断方法为：当扩增产物对应snp位点为tt基因型时，判断待测大豆具有二粒大荚性状。

15、本发明具有以下有益效果：

16、本发明通过全基因组关联分析的方法，在大豆2号染色体上检测到一个与二粒荚大小极显著关联的snp位点s02_5725405，明确了t等位基因与大二粒荚表型的关联关系；基于该snp位点，开发了特异性kasp分子标记及引物组，可适配高通量、大批量种质样本检测，且不受环境条件和植株、生育时期限制。本发明发掘的snp位点及开发的kasp分子标记可提高大荚型鲜食大豆品种改良效率，缩短育种周期，降低育种成本。

1.大豆二粒荚大小相关的kasp分子标记s02_5725405，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述核苷酸序列第200位的碱基为snp位点，多态性为c或t，所述snp位点为tt基因型的大豆二粒荚的荚长和荚宽大于该位点为cc和ct基因型的大豆二粒荚。

2.一种扩增权利要求1所述分子标记的特异性引物，其特征在于，所述引物包括如seqid no.2所示的上游通用引物，如seq id no.3和seq id no.4所示的下游等位基因特异性引物。

3.一种检测大豆二粒荚大小的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的特异性引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×kasp mastermix。

5.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述特异性引物或权利要求3所述试剂盒在鉴定大豆二粒荚大小中的应用。

6.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述特异性引物或权利要求3所述试剂盒在大豆育种或辅助大豆育种中的应用，其特征在于，所述辅助大豆育种是培养大荚型的大豆。

7.一种鉴定大豆二粒荚大小的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的一种鉴定大豆二粒荚大小的方法，其特征在于，所述判断方法为：当扩增产物对应snp位点为tt基因型时，判断待测大豆具有大二粒荚性状。