一种鸡鹿角冠分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学与家禽分子标记辅助育种，具体涉及一种鸡鹿角冠分子标记及其应用。

背景技术：

1、目前国内已公开授权的鸡鹿角冠检测有3项相关专利，分别为cn111394473a、cn116397034a、cn121667166a，覆盖了传统测序分型、taqman荧光定量检测、鹿角冠品系选育三大技术方向，是当前鹿角冠分子鉴定与育种的主流技术，具体技术方案如下所述。

2、（1）cn111394473a（2020年公开）：公开了一种鸡鹿角冠snp位点的sanger测序分型技术，通过苯酚-氯仿法提取血液dna，经多重pcr扩增、产物纯化、延伸反应后测序，依据第44位核苷酸变异区分gg纯合、ag杂合基因型，通过淘汰杂合子实现鹿角冠性状提纯，核心依赖一代测序完成分型检测。

3、（2）cn116397034a（2023年公开）：公开了基于19号染色体15kb拷贝数变异的鹿角冠taqman-qpcr检测技术，设计特异性引物与荧光探针，通过检测样本rq值区间区分aa、aa、aa三种基因型，可区分鹿角冠、单冠、三叉冠性状，解决了传统表型鉴定混淆的问题。

4、（3）cn121667166a（2026年公开）：公开了鹿角冠胡须黄鸡的三系配套选育方法，依托pcr-hrm分型技术检测鹿角冠gg/ag基因型与胡须mbmb/mbmb基因型，通过多代杂交、横交、自交培育稳定性状品系，聚焦品种选育与产业化应用，未优化检测核心技术体系。

5、经对标上述全部现有授权专利，现有鹿角冠检测技术均存在明显技术短板，无法适配商业化大规模育种的高效、低成本、高通量需求，具体缺陷如下：

6、（1）cn111394473a测序技术通量极低、成本高昂、操作繁琐：该专利依赖sanger一代测序，需经过pcr扩增、产物纯化、延伸、变性、上机测序多步复杂操作，单批次检测样本量有限，检测周期长达8小时以上；且单样本测序成本高，大规模育种群体筛查成本压力极大，同时操作流程人工干预多，误差风险高，完全无法适配规模化育种场景。

7、（2）cn116397034a的taqman-qpcr技术体系复杂、判读易偏差、通用性弱：该技术依赖拷贝数变异的rq值相对定量判读，需严格统一对照组样本、dna浓度、扩增体系，实验条件容错率极低，不同设备、批次实验易出现rq值波动，导致基因型误判；同时需要定制特异性荧光探针，探针合成成本高、周期长，且无法实现仪器全自动聚类分型，仍需人工计算判读，标准化程度低。

8、（3）cn121667166a的hrm分型技术稳定性差、分辨率有限：该专利采用的pcr-hrm高分辨率熔解曲线分型技术，依赖熔解温度差值区分基因型，受pcr体系杂质、扩增效率、设备温度精度影响极大，杂合子与纯合子峰型易重叠，分型准确率不稳定，且仅适配特定机型设备，通用落地性差。

9、（4）行业通用技术共性缺陷：现有三项已授权专利技术均未实现一步法全自动高通量分型，要么依赖后续纯化、测序、熔解曲线分析等二次操作，要么判读标准依赖人工校准，存在效率低、通量小、成本高、重复性差、通用性弱的共性问题，目前行业内尚无适配大规模商业化育种的kasp快速分型技术体系。

10、总而言之，现有鹿角冠检测技术分别依托测序、探针定量、熔解曲线原理，技术体系本身存在固有局限，无法兼顾高精度、高通量、低成本、易落地四大核心需求。目前专利领域及行业技术中，缺乏一种基于kasp技术的鸡鹿角冠专属分子标记检测方案，无法实现全自动、标准化、规模化的基因型快速鉴定，制约了鹿角冠特色鸡种的高效选育与产业化推广。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种鸡鹿角冠分子标记及其应用以解决上述的技术问题。

2、针对现有技术及传统检测方案存在的操作繁琐、通量低、成本高、判读不稳定、通用性差、难以规模化应用的技术缺陷，本发明旨在提供一种鸡鹿角冠分子标记及其应用。该分子标记是一种基于kasp技术的鸡鹿角冠分子标记。

3、本发明突破现有测序、taqman-qpcr、hrm分型技术的固有局限，开发专属kasp分子标记与引物体系，建立一步法全自动荧光分型检测方案，实现鸡鹿角冠三种基因型的快速、精准、低成本、高通量鉴定，以填补现有专利技术的行业空白，大幅提升鸡鹿角冠种质筛选与分子辅助育种的效率，适配商业化大规模育种场景。

4、根据本发明的第一方面，本发明提供了一种鸡鹿角冠分子标记，所述分子标记包含鸡19号染色体第1131994位的snp位点。

5、在一些实施方式中，所述snp位点的等位基因为a和g；a为野生型等位基因，g为突变型等位基因。所述snp位点位于鸡19号染色体hsf5关联区段。

6、根据本发明的第二方面，本发明提供了一种用于检测上述鸡鹿角冠分子标记的kasp引物组，其包含两条等位基因特异性上游引物与一条通用下游引物；所述两条等位基因特异性上游引物的序列分别如seq id no:1、seq id no:2所示；所述通用下游引物的序列如seq id no:3所示。

7、在一些实施方式中，seq id no:1所示的序列5'端连接fam荧光尾巴序列；seq idno:2所示的序列5'端连接hex荧光尾巴序列。

8、根据本发明的第三方面，本发明提供了一种kasp引物预混液，其由上述的鸡鹿角冠分子标记的kasp引物组配制而成。

9、在一些实施方式中，所述的kasp引物预混液，其包含100 μm的特异性引物1-fam储备液（对应seq id no:1所示的引物序列再连接fam荧光尾巴序列）、100μm的特异性引物2-hex储备液（对应seq id no:2所示的引物序列再连接hex荧光尾巴序列）、100μm的通用反向引物储备液（对应seq id no:3所示的引物序列）。

10、根据本发明的第四方面，本发明提供了一种鸡鹿角冠性状的kasp荧光pcr检测试剂盒，其包含所述的鸡鹿角冠分子标记的kasp引物组或所述的kasp引物预混液以及kaspmaster mix。

11、根据本发明的第五方面，本发明提供了一种鸡鹿角冠性状基因型的检测方法，包括如下步骤：

12、（1）提取待测鸡基因组的总dna作为待测样品；

13、（2）采用鸡鹿角冠分子标记的kasp引物组或kasp引物预混液对步骤（1）所述待测样品进行kasp扩增反应，得到扩增产物，采集fam、hex荧光信号，根据荧光信号判断待测鸡的鹿角冠性状的基因型。

14、在一些实施方式中，所述根据荧光信号判断待测鸡的鹿角冠性状的基因型，包括：若待测样品仅检测到fam荧光信号，判定待测鸡的鹿角冠性状基因型为野生型纯合基因型；若待测样品仅检测到hex荧光信号，判定待测鸡的鹿角冠性状基因型为突变型纯合基因型；若待测样品同时检测到fam与hex两种荧光信号，则判定待测鸡的鹿角冠性状基因型为杂合基因型；无有效荧光信号的样本判定为分型失败，需要重新提取dna再进行检测。

15、根据本发明的第六方面，本发明提供了所述鸡鹿角冠分子标记、所述鸡鹿角冠分子标记的kasp引物组、所述kasp引物预混液或所述kasp荧光pcr检测试剂盒在鸡鹿角冠分子标记辅助育种中的应用。

16、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

17、（1）本发明的核心技术体系包含三大部分：鸡鹿角冠性状特异性snp分子标记位点、适配kasp技术的特异性扩增引物组、鸡鹿角冠基因型高通量检测方法及育种应用体系；整体技术无需酶切、电泳、纯化、测序、熔解曲线分析等任何后续二次操作，基于通用荧光定量pcr平台实现一步法扩增、实时荧光全自动聚类分型，可精准区分鹿角冠纯合显性（gg）、杂合（ag）、纯合隐性（aa）三种基因型，适配上百份样本同时批量检测，落地门槛低、通用性强。

18、（2）本发明提供的鸡鹿角冠分子标记与鸡鹿角冠性状显著关联，特异性强，无非特异性扩增干扰；配套kasp引物经过特异性优化，无引物二聚体、无错配扩增，分型稳定性和准确率远超现有技术，可适配各类常规荧光pcr检测设备，适合全行业实验室普及应用。