一种鉴定翘嘴鳜XX、XY和YY性别的SNP标记及其应用的制作方法

本发明涉及基因检测，特别涉及一种鉴定翘嘴鳜xx、xy和yy性别的snp标记及其应用。

背景技术：

1、翘嘴鳜（

siniperca chuatsi）隶属于鲈形目（perciformes）、鮨亚目（percoidei）、鳜科（sinipercidae）、鳜属（

siniperca），俗称鳜鱼、桂花鱼等。该物种主要分布于我国长江流域及其以南水系，在我国具有悠久的养殖历史，是重要的淡水经济养殖鱼类之一，具有较高的经济价值和稳定的市场需求。翘嘴鳜具有生命力强、生长速度快、养殖周期短等特点，一般养殖当年即可上市，其肉质细嫩、刺少味美，深受养殖者和消费者的青睐。随着人工繁育技术和规模化养殖的不断发展，对翘嘴鳜优质苗种和良种选育的需求持续增加。在人工繁育、家系构建及选择育种过程中，准确鉴定亲鱼的雌雄性别是获得稳定繁殖效果和开展系统育种工作的前提条件。然而，在实际生产和育种过程中，翘嘴鳜的性别鉴定仍面临较大困难。翘嘴鳜个体通常在养殖满一年后方可达到首次性成熟，在性成熟之前，雌雄个体在外部形态上几乎不存在明显差异，难以通过形态学方法进行准确区分；即使在性成熟阶段，性别判定也通常仅能在繁殖季节通过所产配子类型进行确认。这一生物学特性在一定程度上制约了翘嘴鳜人工繁育效率、家系构建进程以及良种选育工作的顺利开展。目前，关于翘嘴鳜性别决定的遗传机制仍有待进一步深入研究，其是否存在异形性别染色体尚未形成一致结论，亦难以从细胞遗传学层面对其遗传性别进行直接鉴定。在胚胎及幼体阶段，雌雄个体在形态学上几乎完全一致，使得性成熟前的性别鉴定难以实现。这些问题不仅给翘嘴鳜养殖生产和育种实践带来较大困扰，也在一定程度上限制了其性别决定机制及性染色体演化等基础遗传学研究的深入开展。

2、近年来，随着高通量测序和基因组学技术的发展，翘嘴鳜的基因组资源不断丰富，已有研究完成了其全基因组测序和染色体水平的基因组组装，为遗传结构解析及功能基因研究奠定了基础。在此基础上，围绕翘嘴鳜性别相关遗传机制的研究逐步展开。通过遗传连锁分析、高密度遗传图谱构建及性别相关区域定位等方法，研究者已识别出与性别分化相关的染色体区域和候选基因，为分子性别标记的开发提供了初步信息。在性别决定研究方面，现有研究结果提示翘嘴鳜可能具有xx/xy型性别决定特征，并表现出一定程度的性别二态性，例如雌雄个体在生长性能方面存在差异。进一步的研究结合高通量测序、全基因组关联分析（gwas）以及基因组覆盖深度比较等技术，定位了性别决定相关区域（sex-determining region，sdr），并筛选出包括amh（anti-müllerian hormone）及其y特异性拷贝amhy在内的候选基因，多组学证据支持其可能参与性别分化过程。此外，已有研究报道了基于ngs技术筛选和验证的性别相关分子标记，部分标记可用于区分雌雄个体，表明利用分子标记开展翘嘴鳜性别鉴定具有一定的研究基础和应用潜力。

3、然而，从现有研究和应用情况来看，目前报道的翘嘴鳜性别相关分子标记主要集中于雌雄二态的区分，在对不同遗传性别基因型，尤其是对yy基因型个体的精确鉴定方面仍显不足，尚未形成一种可在生产实践中稳定应用的技术体系。因此，开发一种能够同时准确区分翘嘴鳜xx、xy和yy三种遗传性别基因型的snp分子标记体系，对于进一步解析翘嘴鳜性别决定的遗传基础、优化亲本选配策略以及推进单性育种和规模化养殖，具有重要的理论价值和产业应用前景。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种鉴定翘嘴鳜xx、xy和yy性别的snp标记及其应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

2、本发明的第一方面在于提供一种用于判断翘嘴鳜性别差异的分子标记。所述分子标记为seq id no:1所示核苷酸序列的第325位的snp位点，所述snp位点的碱基为a或g，aa基因型对应xx雌性个体，ag基因型对应xy雄性个体，gg基因型对应yy超雄性个体。

3、所述分子标记为单碱基snp标记，其分型稳定、重复性好，不受养殖环境、发育阶段影响，可同时支撑全雌育种与全雄育种两条技术路线，应用场景广泛。

4、本发明第二方面提供了一种用于扩增本发明第一方面所述分子标记的引物组合物。所述引物组合物包括核苷酸序列如seq id no:2所示的上游引物和核苷酸序列如seqid no:3所示的下游引物。所述引物组合物针对snp位点侧翼的保守序列进行定向设计，扩增特异性强，仅能扩增得到目标片段，无明显非特异性扩增产物，测序背景干净，可有效提升后续碱基判读的准确率。同时引物扩增效率优异，对低浓度、低纯度的基因组dna模板具有良好耐受性，能够适配水产养殖现场快速提取的粗模板样本，降低了检测前处理的技术门槛与样本准备成本。

5、本发明第三方面在于提供一种检测试剂盒。所述检测试剂盒包括本发明第二方面所述引物组合物。

6、在本发明第三方面的进一步实施方式中，所述检测试剂盒还包括dna聚合酶、mg2+、dntp、pcr buffer以及无菌水中的一种或多种。

7、在本发明第三方面的进一步实施方式中，dna聚合酶选自dna聚合酶ⅰ、dna聚合酶ⅱ、dna聚合酶ⅲ、dna聚合酶ⅳ和dna聚合酶v；优选地，所述dna聚合酶为rtaq酶。选用rtaq酶作为试剂盒的dna聚合酶，在保障扩增效率与扩增成功率的同时，具备适中的成本优势，其较强的模板耐受性能够适配水产样本dna质量不均的特点，在保证检测效果的前提下控制了试剂盒的整体生产成本，更符合大规模育种筛选场景下的经济性要求。

8、本发明第四方面在于提供一种鉴定翘嘴鳜性别的方法。所述鉴定方法包括以下步骤：

9、1）取待检翘嘴鳜的基因组dna样品；

10、2）以所述基因组dna样品为模板，采用本发明第二方面所述引物组合物或本发明第三方面所述检测试剂盒进行pcr扩增；

11、3）对扩增产物进行碱基测序，通过本发明第一方面所述分子标记的基因型判断待检翘嘴鳜的性别。

12、所述鉴定方法操作难度较低，普通分子生物学实验室即可独立开展。该方法可实现高通量检测，单次可处理数十至上百份样本，能够满足良种场大批量鱼苗、亲本的性别筛查需求，且整体检测周期短，当日即可获得鉴定结果，可快速支撑育种决策。

13、在本发明第四方面的进一步实施方式中，步骤2）中所述pcr扩增的反应体系以25µl计包括10×pcr buffer 2.5 μl、50 ng/μl的基因组dna样品1 μl、0.2~0.4 μmol/l的上游引物1 μl、0.2~0.4 μmol/l的下游引物1 μl、0.2~0.4 mmol/l的dntp 0.8 μl和0.025~0.05 u/μl的dna聚合酶0.75 μl。

14、在本发明第四方面的进一步实施方式中，步骤2）中所述pcr扩增的反应程序包括：94~95 ℃持续3~5分钟；94~95 ℃持续28~35秒，53~63 ℃持续28~35秒，72 ℃持续28~40秒，循环30~40次；72 ℃持续5~15分钟。

15、本发明第五方面在于提供一种分子标记的开发方法。所述开发方法包括以下步骤：

16、选取翘嘴鳜雄性和雌性各30条提取dna，使用dnbseq-t7测序平台分别进行全基因组建库及双端测序，测序量不低于10g；

17、使用bwa的mem算法将质控后的测序数据比对到瓦氏黄颡鱼参考基因组；

18、使用gatk变异检测流程对比对结果进行分析，得到差异序列，包括单核苷酸多态性位点以及小片段的插入缺失；

19、通过全基因组关联分析，在性别决定区域内筛选雌雄差异的snp位点，得到的差异序列即为雄性特异的差异序列。

20、所述开发方法基于全基因组重测序结合全基因组关联分析筛选性别关联snp位点，定位精度高，可直接锁定性别决定区域内的紧密连锁标记，假阳性率远低于传统分子标记筛选方法。该开发流程标准化程度高、可复制性强，通过大样本雌雄群体测序比对，能够保障筛选得到的标记在不同翘嘴鳜地理种群、选育品系中具备通用性，避免因品系特异性导致的鉴定失效，同时该方法无需依赖翘嘴鳜的精细参考基因组图谱，通过比对近缘物种基因组即可完成变异检测，降低了标记开发的技术门槛，可推广应用于其他水产养殖鱼类的性别分子标记开发工作。

21、与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：

22、1、所述分子标记与翘嘴鳜性别决定区域紧密连锁，可在基因组水平精准区分xx、xy、yy三种基因型，鉴定准确率可达100%，不存在表型鉴定的误差。

23、2、利用所述分子标记无需等待鱼体性成熟，可在鱼苗期甚至鱼卵阶段完成遗传性别鉴定，大幅缩短育种周期，解决了现有技术只能在繁殖季节通过所产配子类型进行确认的技术问题。