一种益智二肽的制备方法与流程

本发明属于多肽合成，涉及一种益智二肽的制备方法。

背景技术：

1、益智二肽（dihexa，cas： 1401708-83-5），化学名称为正己酸-酪氨酸-异亮氨酸-（6）氨基己酸酰胺；英文缩写hex-tyr-ile-acp-nh2，是一种具有口服活性的神经肽类化合物。该化合物是由华盛顿州立大学的研究团队研发的小肽，能够穿透血脑屏障，主要通过高亲和力结合肝细胞生长因子（hgf）并增强其受体c-met的活性来发挥生物学功能，研究数据显示其结合解离常数kd仅为65 pm。益智二肽的效能比脑源性神经营养因子（bdnf）强七个数量级，旨在提升特定的认知功能，增强心理韧性，同时改善短期和长期的记忆能力。

2、在药理研究方面，益智二肽已展现出多方面的生物活性。体外实验表明，它能诱导海马神经元棘发生和突触发生，而海马区正是学习与记忆的关键脑区。动物实验进一步验证了其认知改善价值：研究发现益智二肽能逆转东莨菪碱诱导的空间学习缺陷，显著缩短老年大鼠的水迷宫逃避潜伏期，提升目标象限停留时间和穿越平台次数。此外，益智二肽还能显著抑制海马区炎症反应，提升突触素（syp）和突触后致密蛋白95（psd95）的表达水平，增加海马树突棘密度，从而保护学习记忆能力。除认知改善外，益智二肽在动物模型中还显示出优异的抗精神病活性，并具有研究阿尔茨海默症的潜力。

3、目前，益智二肽主要通过化学合成的方式进行制备，但现有合成工艺所制备的益智二肽普遍存在纯度较低、收率较差的问题。常见的多肽合成方法主要包括固相法和液相法，其中固相法合成操作方便且易于合成长链肽，但其依托于树脂作为载体，属于非均相反应体系，在合成过程中会消耗大量的氨基酸、偶联试剂以及有机试剂，导致成本较液相合成更高。而益智二肽在实验或应用中，对其纯度有一定要求，低纯度的益智二肽可能导致实验结果不准确、生物活性降低、实验重复性差等问题。因此，迫切需要开发一种能够高纯度、高收率地合成益智二肽的新型方法，以满足科研和应用领域的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明属于多肽合成技术领域，涉及一种益智二肽的制备方法。

2、针对上述技术问题，本发明的目的在于通过液相合成法制备含益智二肽，产物纯度高、收率高、耗时短、成本低，且经过工业化大规模生产验证。

3、本发明的目的之一在于提供一种益智二肽，其结构式如下：

4、。

5、本发明的目的之一在于提供一种益智二肽的制备方法，其包含以下步骤：

6、（1）将boc-l-ile-oh（n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸）与h-acp-or（6-氨基己酸酯）进行偶联，制得boc-l-ile-acp-or（n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸-(6)-氨基己酸酯）（如图1所示）；

7、（2）将boc-l-ile-acp-or与发生氨解反应制得boc-l-ile-acp-nh2（n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸-(6)-氨基己酸酰胺）（如图2所示）；

8、（3）将boc-l-ile-acp-nh2脱除boc保护得h-l-ile-acp-nh2（异亮氨酸-(6)-氨基己酸酰胺）（如图3所示）；

9、（4）将己酸（hexanoic acid）与h-l-tyr-or（酪氨酸酯）偶联，然后水解制得hex-l-tyr-oh（己酰基-l-酪氨酸）（如图4所示）；

10、（5）将hex-l-tyr-oh与h-l-ile-acp-nh2偶联，制得hex-tyr-ile-acp-nh2（益智二肽）（如图5所示），

11、其中，上述h-acp-or和h-l-tyr-or中的r为甲基或乙基。

12、根据一种优选实施方式，步骤（1）中，将boc-ile-oh与h-acp-ome.hcl在活化剂、缚酸剂、缩合剂存在下于溶剂中进行偶联反应，制得boc-l-ile-acp-ome（n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸-(6)-氨基己酸甲酯）。优选地，将h-acp-ome.hcl溶于有机溶剂中，加入缚酸剂、boc-ile-oh和活化剂，搅拌，控制温度为-10~-5 ℃，加入缩合剂，搅拌，升温至15~20 ℃反应，反应结束，固液分离，液体依次用ph 3-4的酸水、ph 8-9的碱水、5% nacl溶液或水洗涤，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入pe（沸程为60~90℃）或正己烷结晶，固液分离，固体干燥，制得boc-l-ile-acp-ome。

13、根据一种优选实施方式，活化剂为1-羟基苯并三氮唑（hobt）或2-肟氰乙酸乙酯（oxyma）。缩合剂为n,n’-二异丙基碳二亚胺（dic，工业级，生产厂家苏州昊帆生物股份有限公司）或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（edci）。缚酸剂为n,n’-二异丙基乙胺（diea）、n-甲基吗啉（nmm）或三乙胺（tea）。有机溶剂为乙酸乙酯（ea）或四氢呋喃（thf）。

14、根据一种优选实施方式，boc-ile-oh、h-acp-ome.hcl、缩合剂、活化剂、缚酸剂的摩尔比为1.0：（1.0~2.0）：（1.2~2.5）：（0.5~2.0）：（1.0~2.0）。优选地，boc-ile-oh、h-acp-ome.hcl、缩合剂、活化剂、缚酸剂的摩尔比为1：1.2：1.2：0.5：1.2。

15、根据一种优选实施方式，步骤（2）中，将boc-l-ile-acp-ome在氨存在下于溶剂中进行氨解化反应制得boc-l-ile-acp-nh2（n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸-(6)-氨基己酸酰胺）。优选地，将boc-l-ile-acp-ome溶于有机溶剂中，加入氨溶液，控制反应温度为40-50℃反应，反应结束，减压浓缩，浓缩液加入ea溶解，液体依次用ph 3-4的酸水、20% nacl溶液洗涤，无水硫酸钠（工业级，成都徐氏化工有限公司）干燥，固液分离，液体浓缩，加入pe结晶，固液分离，固体干燥，制得boc-l-ile-acp-nh2。

16、根据一种优选实施方式，步骤（2）中，氨溶液为氨气的甲醇溶液或氨的水溶液。溶剂为甲醇。

17、根据一种优选实施方式，boc-l-ile-acp-ome和氨的摩尔比为1：2.0~8.0。优选地，boc-l-ile-acp-ome和氨的摩尔比为1：2、3、4、5、6、7、8以及该范围中的任一数值。

18、根据一种优选实施方式，步骤（3）中，将boc-l-ile-acp-nh2与强酸在溶剂中脱除boc保护得h-l-ile-acp-nh2（异亮氨酸-(6)-氨基己酸酰胺）。优选地，将boc-l-ile-acp-nh2溶于有机溶剂中，控制温度在0-10℃以内，加入酸催化剂，并调节酸浓度，搅拌升温至15~25℃反应，反应结束，减压浓缩，残渣加入ea结晶、固液分离，固体加入thf搅洗，固液分离，干燥，制得h-l-ile-acp-nh2。

19、根据一种优选实施方式，步骤（3）中，酸催化剂为对甲苯磺酸（tsoh）或氯化氢（hcl）。溶剂为ea或dcm。

20、根据一种优选实施方式，步骤（3）中，以dcm为溶剂，15-25℃条件下，tsoh为酸催化剂，反应酸浓度为0.5~2.0 mol/l，反应时间为0.5~2 h。ea为溶剂，15-25℃条件下，hcl为酸催化剂，反应酸浓度为2~4 mol/l，反应时间为0.5~2 h。优选地，反应时间为0.5、1、1.5、2 h以及该范围中的任一数值。反应酸浓度为0.5、1.0、1.5、2 mol/l以及该范围中的任一数值。

21、根据一种优选实施方式，步骤（4）中，将hexanoic acid、h-l-tyr-ome.hcl、缚酸剂、缩合剂存在下于溶剂中进行偶联反应，随后碱性催化下在溶剂中进行水解反应制得hex-l-tyr-oh（己酰基-l-酪氨酸）。优选地，将hexanoic acid溶于有机溶剂，加入缩合剂，搅拌，20-30℃，活化反应一段时间，降温至-10~0℃，加入h-l-tyr-ome.hcl、缚酸剂，升温至15~25 ℃反应，反应结束，加入碱，控制水解ph 11~12，15~25 ℃反应，反应结束，调节ph为8~9，乙酸乙酯即ea和pe萃取除杂，水相调节ph至2-3，搅拌析晶，固液分离，固体干燥，制得hex-l-tyr-oh。

22、根据一种优选实施方式，步骤（4）中，缩合剂为三甲基乙酰氯（piv-cl）、羰基二咪唑（cdi）。缚酸剂为diea、nmm或tea。碱为naoh（工业级，成都金山化学试剂有限公司）或氢氧化钾(koh)。有机溶剂为四氢呋喃。

23、根据一种优选实施方式，步骤（4）中，在thf为有机溶剂下，hexanoic acid、h-l-tyr-ome、piv-cl、缚酸剂、碱的摩尔比为1.0：（1.0~2.5）：（1.0~2.0）：（2.0~5.0）：（2.0~4.0）。优选地，hexanoic acid、h-l-tyr-ome、piv-cl、缚酸剂、碱的摩尔比为1.2：1.0：1.1：2.3：2.5。

24、在thf为溶剂下，hexanoic acid、h-l-tyr-ome、cdi、缚酸剂、碱的摩尔比为1.0：（1.0~2.5）：（1.0~2.5）：（1.0~2.0）：（2.0~4.0）。优选地，hexanoic acid、h-l-tyr-ome、cdi、缚酸剂、碱的摩尔比为1.2：1.0：1.1：2.3：2.5。

25、根据一种优选实施方式，步骤（5）中，将hex-l-tyr-oh与h-l-ile-acp-nh2在缚酸剂、缩合剂存在下于溶剂中进行偶联反应，制得hex-tyr-ile-acp-nh2，即益智二肽。优选地，将hex-l-tyr-oh溶于有机溶剂，控制温度为-10~-5 ℃，加入缩合剂，然后再加入h-l-ile-acp-nh2，缚酸剂，升温至15-25 ℃反应，反应结束，固液分离，固体加入溶剂重结晶，制得hex-tyr-ile-acp-nh2。

26、根据一种优选实施方式，步骤（5）中，缩合剂为n-乙炔基-n,4-二甲基苯磺酰胺（mytsa）或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（pybop）。缚酸剂为diea、nmm或tea。溶剂为四氢呋喃溶液。优选地，hex-l-tyr-oh、h-l-ile-acp-nh2、缩合剂、缚酸剂摩尔比为1.0：（1.0~2.0）：（0.9~2.0）：（1.0~2.5）。更为优选地，hex-l-tyr-oh、h-l-ile-acp-nh2、缩合剂、缚酸剂摩尔比为1.0：1.0：1.1：1.2。

27、本发明的有益效果：

28、采用现有技术中所述的“2+1+1”的合成方式制备hextyrileacpnh2，虽能够合成得到目标分子，但存在产物纯度降低、杂质组分增加的问题，合成表现不及本发明实施例13所采用的“2+2”合成方法。本发明提供的益智二肽制备方法，可实现目标产物高纯度、高收率制备，具备耗时短、成本低的优势，已完成工业化大规模生产验证。