天冬氨酸氨基转移酶突变体及其在生产L-异亮氨酸中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及天冬氨酸氨基转移酶突变体及其在生产l-异亮氨酸中的应用。

背景技术：

1、l-异亮氨酸是人体及动物无法合成的必需支链氨基酸，在调节蛋白质合成、血糖平衡和免疫信号中起核心作用，全球年需求量已突破6万吨，70%用于高端饲料，其余用作肠外营养输液、运动营养强化剂。

2、目前异亮氨酸的工业生产几乎全部采用微生物直接发酵法，但野生型菌株受多重反馈抑制，且副产缬氨酸、亮氨酸比例高，下游离子交换分离成本占总成本40%以上。随着“非粮”原料路线和绿色制造政策推进，亟需构建高效细胞工厂。

3、现有野生菌株中天然代谢酶的催化性能存在固有缺陷，催化效率有限、底物适配性较差，难以满足高密度发酵、高产物积累的工业化生产需求，导致整体发酵产能与原料利用率难以进一步提升。针对上述技术现状，开发性能更优异的突变酶体并将其应用于l-异亮氨酸发酵生产，对优化菌株代谢合成能力、提升发酵产量、减少副产物生成、降低生产成本具有重要的现实意义与工业应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供天冬氨酸氨基转移酶突变体及其在生产l-异亮氨酸中的应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种天冬氨酸氨基转移酶突变体。

3、本发明所要求保护的天冬氨酸氨基转移酶突变体包括或为如下任一种：

4、a1）野生型天冬氨酸氨基转移酶的第204位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸后所得的蛋白质；

5、a2）a1）所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的来源于谷氨酸棒杆菌的蛋白质；

6、a3）与a1）或a2）所限定的氨基酸序列至少具有90%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

7、a4）在a1）-a3）中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

8、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

9、上述蛋白质中，所述至少具有90%同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

10、进一步地，a1）中，所述野生型天冬氨酸氨基转移酶为谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶。相应地，a2）和a3）中所述蛋白质为来源于谷氨酸棒杆菌的蛋白质。

11、更进一步地，所述野生型天冬氨酸氨基转移酶（即谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶）的氨基酸序列包含seq id no:8。在本发明的一些实施案例中，所述野生型天冬氨酸氨基转移酶（即谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶）的氨基酸序列为seq id no:8。

12、更加具体地，所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的氨基酸序列包含seq id no:12所示。在本发明的一些实施案例中，所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的氨基酸序列为seq idno:12。

13、第二方面，本发明要求保护生物材料。

14、本发明所要求保护的生物材料包括或为下述任一种：

15、b1）编码前文第一方面中所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的核酸分子；

16、b2）含有b1）所述核酸分子的表达盒；

17、b3）含有b1）所述核酸分子的重组载体或含有b2）所述表达盒的重组载体；

18、b4）含有b1）所述核酸分子的重组微生物或含有b2）所述表达盒的重组微生物或含有b3）所述重组载体的重组微生物；

19、b5）含有b1）所述核酸分子的全细胞催化剂或含有b2）所述表达盒的全细胞催化剂或含有b3）所述重组载体的全细胞催化剂或含有b4）所述重组微生物的全细胞催化剂。

20、进一步地，b1）中所述的核酸分子包含或为如下b11）或b12）或b13）：

21、b11）包含或为seq id no:11所示编码序列的核酸分子；

22、b12）与b11）所述核酸分子具有80%以上的一致性且编码前文第一方面中所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的核酸分子；

23、b13）在严格条件下与b11）或b12）所限定的核酸分子杂交且编码前文第一方面中所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的核酸分子。

24、上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（sds）、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1% sds中漂洗；还可为：50℃，在7％ sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1% sds中漂洗；还可为：50℃，在7％ sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1% sds中漂洗；还可为：50℃，在7％ sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1% sds中漂洗；还可为：50℃，在7％ sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1% sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5% sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1% sds和1×ssc，0.1% sds各洗膜一次。

25、上述核酸分子中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastn作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

26、上述核酸分子中，所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

27、在本发明的一些实施案例中，b1）中所述核酸分子的编码序列为seq id no:11。

28、上述的生物材料中，所述微生物可为细菌。

29、进一步地，所述细菌为具有生产l-异亮氨酸能力的细菌。

30、“具有生产l-异亮氨酸能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质（如培养基），在细菌体内产生并累积l-异亮氨酸的能力，进一步还可包括将l-异亮氨酸分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集l-异亮氨酸。

31、所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。

32、“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。

33、更进一步，所述细菌可为棒状杆属细菌。在本发明的一些实施案例中，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。

34、在b5）中，所述全细胞催化剂以所述重组微生物为功能核心，其细胞内异源表达的所述天冬氨酸氨基转移酶突变体可直接催化目标反应，无需对酶进行分离纯化，借助细胞内天然微环境可维持酶的催化稳定性，同时微生物自身代谢能实现辅酶的自给与再生，简化催化反应流程，适合工业化大规模应用。

35、第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的天冬氨酸氨基转移酶突变体或前文第二方面中所述的生物材料在如下任一中的应用：

36、p1、生产l-异亮氨酸；

37、p2、提高受体菌中l-异亮氨酸产量；

38、p3、构建产l-异亮氨酸的工程菌；

39、p4、制备含l-异亮氨酸的产品。

40、其中，p2中的所述受体菌和p3中的所述工程菌均可为细菌。

41、进一步地，所述细菌为具有生产l-异亮氨酸能力的细菌。

42、“具有生产l-异亮氨酸能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质（如培养基），在细菌体内产生并累积l-异亮氨酸的能力，进一步还可包括将l-异亮氨酸分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集l-异亮氨酸。

43、所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。

44、“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。

45、更进一步，所述细菌可为棒状杆属细菌。在本发明的一些实施案例中，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。

46、第四方面，本发明要求保护一种重组谷氨酸棒杆菌。

47、本发明所要求保护的重组谷氨酸棒杆菌包含或为下述任一种：

48、c1）含有前文第一方面中所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的编码基因的重组谷氨酸棒杆菌；

49、c2）通过在受体谷氨酸棒杆菌中增强表达天冬氨酸氨基转移酶编码基因获得的重组谷氨酸棒杆菌。

50、其中，所述天冬氨酸氨基转移酶为前文第一方面中所述谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶或前文第一方面中所述的天冬氨酸氨基转移酶突变体。

51、进一步地，在所述c2）中，可通过如下任一方式增强表达所述天冬氨酸氨基转移酶的编码基因：

52、c1）将受体谷氨酸棒杆菌基因组中poxb基因的编码区替换为前文第一方面中所述的野生型天冬氨酸氨基转移酶的编码基因表达盒；

53、c2）对受体谷氨酸棒杆菌基因组中的前文第一方面中所述的野生型天冬氨酸氨基转移酶的编码基因进行点突变，所述点突变使得所述野生型天冬氨酸氨基转移酶的第204位氨基酸残基由苏氨酸（t）突变为丝氨酸（s）；

54、c3）将所述受体谷氨酸棒杆菌基因组中poxb基因的编码区替换为前文第一方面中所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的编码基因表达盒；

55、c4）向所述受体谷氨酸棒杆菌基因组中导入携带有前文第一方面中所述野生型天冬氨酸氨基转移酶的编码基因的重组载体（以游离质粒的形式存在）；

56、c5）向所述受体谷氨酸棒杆菌基因组中导入携带有前文第一方面中所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的编码基因的重组载体（以游离质粒的形式存在）。

57、其中，所述c1）所得重组谷氨酸棒杆菌记作重组谷氨酸棒杆菌1，所述c2）所得重组谷氨酸棒杆菌记作重组谷氨酸棒杆菌2，所述c3）所得重组谷氨酸棒杆菌记作重组谷氨酸棒杆菌3，所述c4）所得重组谷氨酸棒杆菌记作重组谷氨酸棒杆菌4，所述c5）所得重组谷氨酸棒杆菌记作重组谷氨酸棒杆菌5。

58、在所述c1）-所述c5）中，所述受体谷氨酸棒杆菌正常表达自身的天冬氨酸氨基转移酶。

59、在本发明一些实施案例中，所述重组谷氨酸棒杆菌1为将所述受体谷氨酸棒杆菌基因组中位于seq id no:1和seq id no:3之间的片段（即poxb基因的编码区）替换为seqid no:2所示片段（所述谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶的编码基因及其启动子片段）后得到的重组菌。进一步地，其他序列保持不变。

60、在本发明的一些实施案例中，所述重组谷氨酸棒杆菌2为将受体谷氨酸棒杆菌基因组中seq id no:7所示核苷酸序列的第610位a突变为t（该突变使得所述谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶的第204位氨基酸残基由t突变为s）后得到的重组菌。进一步地，其他序列保持不变。

61、在本发明的一些实施案例中，所述重组谷氨酸棒杆菌3为将所述受体谷氨酸棒杆菌基因组中位于seq id no:1和seq id no:3之间的片段（即poxb基因的编码区）替换为seqid no:13所示片段（所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的编码基因及其启动子片段）后得到的重组菌。进一步地，其他序列保持不变。

62、在本发明的一些实施案例中，所述重组谷氨酸棒杆菌4为向所述受体谷氨酸棒杆菌中导入携带seq id no:7（即所述谷氨酸棒杆菌来源的野生型天冬氨酸氨基转移酶的编码基因）的重组载体后得到的重组菌。具体地，所述重组载体为将seq id no:7克隆到pxmj19质粒后所得。

63、在本发明的一些实施案例中，所述重组谷氨酸棒杆菌5为向所述受体谷氨酸棒杆菌中导入携带seq id no:11（即所述天冬氨酸氨基转移酶突变体的编码基因）的重组载体后得到的重组菌。具体地，所述重组载体为将seq id no:11克隆到pxmj19质粒后所得。

64、在上述各相关方面中，在本发明的一些实施案例中，所述谷氨酸棒杆菌（或所述受体谷氨酸棒杆菌）为谷氨酸棒杆菌（

corynebacterium glutamicum）cgmcc no.20437。在本发明的另一些实施案例中，所述谷氨酸棒杆菌（或所述受体谷氨酸棒杆菌）为谷氨酸棒状杆菌atcc13032。

65、第五方面，本发明要求保护前文第四方面中所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产l-异亮氨酸中的应用。

66、第六方面，本发明要求保护一种生产l-异亮氨酸的方法。

67、本发明要求保护的生产l-异亮氨酸的方法，可包括如下步骤：对前文第五方面中所述的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵培养，从发酵产物中获得l-异亮氨酸。

68、其中，培养所述重组谷氨酸棒杆菌是本领域技术人员可以采用现有技术中方法进行的，也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行所述发酵培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素及其组合。在培养中，可以调节培养物的ph。在培养中，可以控制培养物的温度。在培养中，可以控制转速。在培养中，可以控制发酵时间。在培养中，可以控制溶氧。

69、在本发明的一些实施案例中，具体采用的培养基配方和发酵工艺参见实施例5相关部分。

70、实验证明，本发明在受体谷氨酸棒杆菌过表达谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸氨基转移酶野生基因

aspb或其突变体

aspba610t（包括整合到基因组上，也包括以游离质粒的形式存在），或者直接将内源的

aspb基因突变为

aspba610t均能够产生更具成本效益l-异亮氨酸发酵生产菌株。本发明对于提高l-异亮氨酸的发酵产量具有重要意义。

71、保藏说明

72、分类命名：谷氨酸棒杆菌（

corynebacterium glutamicum）；

73、参椐的生物材料：ypile001

74、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

75、保藏机构简称：cgmcc；

76、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

77、保藏日期：2020年8月17日；

78、保藏中心登记入册编号：cgmcc no. 20437。