一种鉴定灯笼形辣椒果实的方法及其专用SNP引物组合

本发明属于生物，具体涉及一种鉴定灯笼形辣椒果实的方法及其专用snp引物组合。

背景技术：

1、辣椒是世界上种植最广泛的香料，也是我国种植面积最大的蔬菜作物。辣椒果实富含维生素c、辣椒素和辣椒红素等多种营养物质，其加工产品多，产业链长，附加值高，在蔬菜产业及人民日常生活中占有十分重要的地位。我国辣椒育种事业历经六十余年发展，已跻身世界前列，迈入了品质育种和精准育种的新阶段。

2、蔬菜果实在形态与特性上展现出广泛的多样性，其中果实形状是重要的商品和感官性状，也是影响总产量的重要质量性状。辣椒种质资源遗传多样性丰富，株形、果形、果色、果重等性状变异广泛，长期的自然演化与人工选育形成了灯笼椒、羊角椒、线椒、朝天椒、螺丝椒等主流商业化品种，可适配不同产区、不同栽培模式与消费场景。其中，灯笼椒凭借果肉肥厚、果形饱满、口感清甜、无辛辣味、营养价值高等优良特性，适配鲜食、配菜、观光采摘等多元场景，市场认可度持续攀升。该品种适应性极强，在我国南北各省市区均可规模化种植，种植分布范围极广，是近年来蔬菜市场、设施农业及都市观光农业中的主流特色品种，整体经济效益与产业推广价值显著。辣椒品种选育及改良长期受到重视，传统的育种方法（系谱选择、回交、杂交等）已不能满足社会发展及外市场竞争的需要，分子标记设计育种将成为辣椒育种的重要途径和发展趋势。

3、单核苷酸多态性(snp)在基因组水平上由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列的多态性，包括单碱基转换、插入及缺失等形式。snp作为第3代分子标记，具有数量多、分布广、易于快速规模化筛查、便于基因分型等特点，是目前被公认的极具应用前景的分子标记技术。果形是辣椒育种的主要目标性状之一，基于灯笼椒的市场地位，开发可以快速鉴定辣椒果实是否为灯笼形的相关分子标记，为辣椒果形筛选和品种选育提供新的途径。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鉴定灯笼形辣椒果实的方法及其专用snp引物组合。该引物组合可用于快速鉴定辣椒果实是否为灯笼形。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明第一方面提供snp引物组合，可包括用于扩增辣椒基因组的denglj3 snp位点的第一引物组和/或用于扩增辣椒基因组的dengl4 snp位点的第二引物组；

4、denglj3 snp位点为9号染色体上的第193057991位核苷酸，其为a或c；

5、denglj4 snp位点为9号染色体上的第193059682位核苷酸，其为t或c；

6、denglj3 snp位点和denglj4 snp位点在染色体上的位置是基于辣椒zunla-1参考基因组序列比对确定的，辣椒zunla-1参考基因组序列的版本号为v2.0。

7、snp引物组合中，第一引物组可以用于鉴定denglj3 snp位点的基因型，第二引物组可以用于鉴定denglj4 snp位点的基因型。第一引物组和第二引物组可以基于kasp原理进行设计。

8、进一步地，所述第一引物组包括第一正向引物、第二正向引物和第一反向引物，其中，第一正向引物的特异性核苷酸序列如seq id no：1自5’末端起第22至43位所示、第二正向引物的核苷酸序列如seq id no：2自5’末端起第22至43位所示和第一反向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示；

9、所述第二引物组包括第三正向引物、第四正向引物和第二反向引物，其中，第三正向引物的核苷酸序列如seq id no：4自5’末端起第22至55位所示、第四正向引物的核苷酸序列如seq id no：5自5’末端起第22至55位所示和第二反向引物的核苷酸序列如seq idno：6所示；

10、为了便于通过荧光信号鉴定snp位点基因型，所述正向引物的5’添加有荧光标签序列，其中第一正向引物和第二正向引物的荧光标签序列的荧光信号颜色不同。第三正向引物和第四正向引物的荧光标签序列的荧光信号颜色不同。

11、上述任一所述snp引物组合可以单独是第一引物组，也可以单独是第二引物组，还可以是由第一引物组和第二引物组组成。

12、上文中，seq id no：1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列（即fam荧光标签序列），荧光信号具体为蓝色。seq id no：2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列（即hex荧光标签序列），荧光信号具体为红色。

13、所述snp引物组合中，作为一种优选实施方式，所述第一引物组可由seq id no：1所示的正向引物1f1、seq id no：2所示的正向引物1f2和seq id no：3所示的反向引物1r组成。所述第二引物组可由seq id no：4所示的正向引物2f1、seq id no：5所示的正向引物2f2和seq id no：6所示的反向引物2r组成。

14、上述任一所述引物组中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物在pcr反应体系中的摩尔比具体可为2:2:5。

15、含有上述任一所述snp引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。因此，本发明第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面的snp引物组合。

16、试剂盒中还可以包括用于进行竞争性等位基因特异性pcr的其它试剂，比如dna聚合酶、缓冲液等。

17、所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

18、本发明第三方面提供上述第一方面所述的snp引物组合或上述第二方面的试剂盒的应用，所述应用为如下两种中的任意一种：（a）在鉴定待测辣椒品种果实为灯笼形还是非灯笼形中的应用；（b）在选育果实为灯笼形辣椒品种中的应用。

19、本发明第四方面提供一种鉴定待测辣椒品种果实为灯笼形还是非灯笼形的方法，包括如下步骤：检测待测辣椒品种基于denglj3 snp位点和/或denglj4 snp位点的基因型，然后进行如下判断：如果基于denglj3 snp位点的基因型为aa型和/或基于denglj4 snp位点的基因型为tt型，则待测辣椒品种果实鉴定为或疑似鉴定为灯笼形；如果基于denglj3snp位点的基因型为cc型或ca型，和/或基于denglj4 snp位点的基因型为cc型或ct型，则待测辣椒品种果实鉴定为或疑似鉴定为非灯笼形；

20、denglj3 snp位点为9号染色体上的第193057991位核苷酸，其为a或c；

21、denglj4 snp位点为9号染色体上的第193059682位核苷酸，其为t或c；

22、denglj3 snp位点和denglj4 snp位点在染色体上的位置是基于辣椒zunla-1参考基因组序列比对确定的，辣椒zunla-1参考基因组序列的版本号为v2.0。

23、上述方法中，所述检测待测辣椒品种基于denglj3 snp位点和/或denglj4 snp位点的基因型的步骤可如下：

24、（1）以待测辣椒品种的基因组dna为模板，分别采用上述第一方面的所述第一引物组和/或上述第一方面的第二引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

25、（2）采用仪器检测步骤（1）得到的pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测辣椒品种基于denglj3 snp位点和/或denglj4 snp位点的基因型。

26、或者，上述方法中，所述检测待测辣椒品种基于denglj3 snp位点和/或denglj4snp位点的基因型的步骤如下：

27、（1）以待测辣椒品种的基因组dna为模板，分别采用上述第一方面所述第一引物组和/或上述第一方面所述第二引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

28、（2）取步骤（1）得到的pcr扩增产物，测序；

29、（3）根据步骤（2）得到的测序结果，获得待测辣椒品种基于denglj3 snp位点和/或denglj4 snp位点的基因型。

30、进一步地，所述根据荧光信号的颜色判断待测辣椒品种基于denglj3 snp位点和/或denglj4 snp位点的基因型的方法如下：如果待测辣椒品种基于denglj3 snp位点显示的荧光颜色与第一正向引物5’端连接的荧光标签序列显示的颜色相同，则该待测辣椒品种基于denglj3 snp位点的基因型为aa；如果待测辣椒品种基于denglj4 snp位点显示的荧光颜色与第三正向引物5’端连接的荧光标签序列显示的颜色相同，则该待测辣椒品种基于denglj4 snp位点的基因型为tt；如果待测辣椒品种基于denglj3 snp位点显示的荧光颜色与第二正向引物5’端连接的荧光标签序列显示的颜色相同，则该待测辣椒品种基于denglj3 snp位点的基因型为cc；如果待测辣椒品种基于denglj4 snp位点显示的荧光颜色与第四正向引物5’端连接的荧光标签序列显示的颜色相同，则该待测辣椒品种基于denglj4 snp位点的基因型为cc；如果待测辣椒品种基于denglj3 snp位点显示的荧光颜色为第一正向引物和第二正向引物5’端连接的荧光标签序列显示颜色的混合色，则该待测辣椒品种基于denglj3 snp位点的基因型为ac；如果待测辣椒品种基于denglj4 snp位点显示的荧光颜色为第三正向引物和第四正向引物5’端连接的荧光标签序列显示颜色的混合色，则该待测辣椒品种基于denglj4 snp位点的基因型为tc。

31、上述任一所述的方法中，“采用上述第一方面所述第一引物组和/或上述第一方面第二引物组进行pcr扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃（选用touch down 程序，每循环降低0.6℃），1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环（94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环），直至结果满意为止。

32、本发明有益效果：

33、随着基因组学技术的发展，辣椒基因组已公布并完成500多份辣椒资源的全基因组重测序，丰富的变异组大数据为筛选辣椒种群特异的遗传位点提供了标记资源。利用灯笼形辣椒和非灯笼形辣椒的种质资源的重测序数据，从全基因组筛选种群特异的遗传位点，进而开发用于鉴定灯笼形辣椒和非灯笼形辣椒的snp引物组合。本发明提供的snp引物组合可用于鉴定待测辣椒品种果实是否为灯笼形，在辣椒各个发育阶段及不同的组织器官提取dna均可检测，不受环境和季节限制，具有操作简单、扩增精准、高通量、低成本等优势，对于农业生产和辣椒品种选育具有重要的应用价值。