一种检测禽白血病病毒A、B、J、K亚群的引物探针组合物及其应用的制作方法

本发明涉及禽类病毒分子检测，特别涉及一种检测禽白血病病毒a、b、j、k亚群的引物探针组合物及其应用。

背景技术：

1、禽白血病作为一类由禽白血病病毒引起的肿瘤性及免疫抑制性传染病，对我国乃至全球养禽业构成持续且重大的威胁，尤其对种禽群体的健康与生产性能影响深远。该病毒可通过垂直与水平途径传播，感染禽只后不仅导致免疫抑制、生长迟缓与产蛋下降，还可诱发包括淋巴细胞性白血病和血管瘤在内的多种肿瘤性疾病，显著升高死亡率并增加继发感染风险，造成严重经济损失。根据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异，禽白血病病毒可分为a至k共11个亚群，其中外源性亚群a、b、j与k具有强致病性与致瘤性，是当前流行与防控的重点。a和b亚群作为传统流行株广泛存在；j亚群致病力强，曾引发全球疫情；而k亚群作为我国近年来新发现的亚型，虽致病性相对较弱，却在地方品种鸡群中呈现高感染率，且因其与内源性e亚群序列同源性高，常规检测难以区分，易于逃逸常规检测，进一步增加了防控复杂性。

2、目前针对该病的防控尚无可用的疫苗或特效药物，主要依赖检测并淘汰感染禽以实现种群净化，因而快速、准确且高通量的检测技术成为净化工作的核心支撑。然而，现有检测方法仍存在明显局限：血清学方法如elisa无法区分病毒亚型及进行精确定量；普通pcr灵敏度有限且操作繁琐，不适用于大规模筛查；而多数已建立的多重荧光定量pcr方案未能实现单管反应内对a、b、j、k这四种关键外源性亚群的全面覆盖。此外，由于k亚群序列特殊性及其与内源性病毒的潜在重组，现有方法对其检测的特异性与可靠性尚存不足，可能导致漏检或交叉反应，难以满足当前种禽净化与流行病学监测中对多亚型同步鉴别、定量及高通量检测的迫切需求。因此，开发一种能够在一个反应体系中同步、特异、灵敏地检测并定量上述四种主要外源性亚群的集成化检测方法，对于推进禽白血病综合防控、提升种禽群健康水平及保障养殖业可持续发展具有重要的科学价值与实践意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种检测禽白血病病毒a、b、j、k亚群的引物探针组合及其应用。本发明提出一种单管四重实时荧光定量pcr（rt-qpcr）检测方案。该方案的核心在于设计并优化了一套针对alv-a、b、j、k四个亚群的高度特异性引物与探针组合，所有设计均精准锚定于各亚型囊膜糖蛋白基因（gp85）内的保守区域，确保了检测的特异性。

2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供了一种引物探针组合物，包括用于检测禽白血病病毒a、b、j、k亚群的引物对和探针；

4、用于检测禽白血病病毒a亚群的引物对序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；

5、用于检测禽白血病病毒b亚群的引物对序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示；

6、用于检测禽白血病病毒j亚群的引物对序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示；

7、用于检测禽白血病病毒k亚群的引物对序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示。

8、在本发明的一些实施方式中，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

9、在本发明的一些实施方式中，所述探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

10、在本发明的一些实施方式中，所述探针的5’端分别标记有fam、vic、rox和cy5荧光基团中的任一种；其3’端分别标记有mgb、bhq淬灭基团中的任一种。

11、本发明的第二个方面，提供了上述方面所述的引物探针组合物在制备多亚群靶点检测禽白血病病毒试剂中的应用。

12、在本发明的一些实施方式中，所述扩增反应包括反转录阶段及循环扩增阶段。

13、在本发明的一些实施方式中，所述反转录阶段在50-55℃保温15-15 min。

14、在本发明的一些实施方式中，所述反转录阶段在50℃保温30 min。

15、在本发明的一些实施方式中，所述循环扩增阶段的程序为：第一步为温度93-97℃，预变性4-6 min，循环1次；第二步为温度93-97℃，变性20-40s后，温度58-62℃，退火28-32s、温度70-74℃，延伸28-32s，循环33-37次后，温度70-74℃，终延伸6-8min。

16、在本发明的一些实施方式中，所述循环扩增阶段于94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s（35循环），72℃终延伸7min。

17、在本发明的一些实施方式中，判定结果前先判定试验有效性：阳性对照各通道ct＜37且有s型扩增曲线、阴性对照无扩增曲线为试验有效，否则试验失效重测。

18、在本发明的一些实施方式中，试验有效时样品判定标准：通道ct＜37为对应亚群阳性；37≤ct＜40复测仍有扩增曲线为对应亚群阳性；ct≥40为阴性。

19、在本发明的一些实施方式中，所述对应亚群阳性包括强阳性和弱阳性两种情形；其中，通道ct＜37且扩增曲线呈对数增长的情形为本发明所述的强阳性；37≤ct＜40且复测后仍有扩增曲线的情形为本发明所述的弱阳性；所述弱阳性样本建议进行后续复核或结合临床综合判断。

20、本发明的第三个方面，提供了一种产品，所述产品包括上述方面所述的引物探针组合物。

21、在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括缓冲液、dna聚合酶和dntp混合液中的至少一种。

22、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒。

23、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、pcr预混液中的至少一种。

24、在本发明的一些实施方式中，所述pcr预混液包括tris-hcl、dntps、mgcl2、kcl、triton x-100、dna聚合酶、udg酶。

25、在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照品包括含有alv-a、alv-b、alv-j、alv-k亚群的核酸分子的重组载体。

26、在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照包括水。

27、本发明的有益效果是：

28、（1）本发明设计的引物探针避开了内源性e亚群的同源序列，能有效区分外源性a、b、j、k亚群与内源性e亚群，避免假阳性，实现了对a、b、j、k四种主要外源性致病亚群的同步、特异鉴别与定量，克服了对流行亚型覆盖不全或需分步检测导致的通量低下问题，能够有效应对临床中多亚群共感染的复杂场景，为流行病学溯源和精准净化决策提供了数据支撑。

29、（2）本发明通过优化的反应体系与程序，将反转录与四重pcr扩增整合于单一闭管反应中。整个检测流程可在约1.5小时内完成，无需pcr后电泳等繁琐且易污染的开盖操作，极大地提升了检测速度与实验室生物安全性。这种高效率、一体化的设计显著节约了试剂成本与人力投入，使其适用于种禽场大规模筛查及诊断实验室的样本分析。