一种定向酶解制备葡聚六糖的方法及诱导蔬菜抗逆的用途

本发明涉及寡糖生物制备及农业生物，具体涉及一种采用定向酶解技术制备高纯度葡聚六糖的方法，以及该葡聚六糖作为植物抗性诱导剂在增强蔬菜抗逆性中的应用。

背景技术：

1、葡聚六糖（glucohexaose）是由 6 个葡萄糖单元通过糖苷键连接而成的功能性寡糖，作为一种重要的植物免疫激发子，能够诱导植物产生系统获得抗性，增强植物对病原菌、低温、干旱等逆境胁迫的抵御能力。与传统化学农药相比，葡聚六糖具有无毒、无残留、环境友好等显著优势，在绿色农业生产中具有广阔的应用前景。

2、目前葡聚六糖的制备方法主要包括化学合成法、酸水解法和酶解法三类。化学合成法步骤繁琐、反应条件苛刻、成本高昂，且易产生有毒副产物，难以规模化生产；酸水解法反应随机性强，产物聚合度分布宽，目标六糖产率低，后续分离纯化难度大，且酸液对设备腐蚀严重、环境污染大。

3、酶解法因反应条件温和、产物专一性强、环境友好而成为研究热点。但现有酶解技术普遍存在以下缺陷：一是所用内切葡聚糖酶的水解位点选择性不足，酶解产物多为聚合度 2-10 的混合寡糖，葡聚六糖占比通常低于 30%；二是缺乏精准的酶解进程调控手段，易出现水解过度或不足的问题；三是后续分离纯化工艺复杂，多采用多次凝胶色谱分离，生产成本高、回收率低。

4、在农业应用方面，现有研究虽证实葡聚六糖可诱导黄瓜抗霜霉病，但关于其适用蔬菜种类、最佳施用浓度、施用方式及抗逆谱的系统研究仍较为欠缺，限制了其产业化应用。因此，开发一种定向酶解效率高、产物纯度高、生产成本低的葡聚六糖制备方法，并明确其诱导蔬菜抗逆的施用技术，具有重要的现实意义。 技术实现要素：

5、（一）解决的技术问题 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，该方法通过复合酶系协同作用与酶解进程精准调控，显著提高葡聚六糖的产率与纯度，简化后续纯化工艺，降低生产成本。

6、本发明的另一目的在于提供上述方法制备的葡聚六糖在诱导蔬菜抗逆中的用途，明确其施用浓度、方式和适用于多种蔬菜的抗逆效果。（二）技术方案

7、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

8、一种定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，包括以下步骤：

9、（1）底物溶液配制：以葡聚糖 t-40 为原料，配制质量浓度为 5%～15% 的底物溶液，调节 ph 至 5.0～6.5，在 95～100℃下预处理 15～30min，冷却至反应温度；

10、（2）定向酶解反应：向底物溶液中加入复合酶制剂，所述复合酶制剂由 α-1,6 -内切葡聚糖酶与 β-1,3 - 葡聚糖酶按酶活比 (4～6):1 组成，加酶量为每克底物 30～80u，在 40～50℃、搅拌转速 100～200rpm 条件下进行酶解反应；

11、（3）酶解进程调控：采用高效液相色谱（hplc）实时监测产物组成，当葡聚六糖在总寡糖中的占比达到峰值时，立即升温至 90～95℃保温 10～15min 灭酶，终止反应；

12、（4）初步分离：将酶解液经活性炭脱色、板框过滤后，采用纳滤膜脱除单糖、二糖及部分三糖，收集截留液；

13、（5）分级纯化：将截留液经凝胶过滤色谱分离，采用去离子水洗脱，在线监测洗脱曲线，收集葡聚六糖组分，经浓缩、冷冻干燥后得到高纯度葡聚六糖成品。

14、进一步地，步骤（2）中所述 α-1,6 - 内切葡聚糖酶来源于朱黄青霉（penicilliumminioluteum）重组毕赤酵母表达菌株，酶活≥500u/ml；所述 β-1,3 - 葡聚糖酶来源于黑曲霉，酶活≥200u/ml。

15、进一步地，步骤（2）中复合酶制剂采用分批添加方式，首次加入总酶量的 60%，反应 4h 后补加剩余 40% 酶液。

16、进一步地，步骤（3）中所述葡聚六糖占比峰值判定标准为：酶解液中葡聚六糖质量占总可溶性糖质量的 45% 以上，且葡聚七糖及以上组分占比低于 15%。

17、进一步地，步骤（4）中所述纳滤膜截留分子量为 300～500da，操作压力为 0.8～1.2mpa，操作温度为 30～40℃。

18、进一步地，步骤（5）中所述凝胶过滤色谱填料为 sephadex g-15，上样量为柱床体积的 5%～10%，洗脱流速为 0.5～1.0 倍柱体积 / 小时。

19、采用上述方法制备的葡聚六糖，纯度≥95%，总收率≥28%。

20、上述葡聚六糖在诱导蔬菜抗逆中的用途：

21、将葡聚六糖配制成浓度为 5～50μg/l 的水溶液，采用叶面喷施方式处理蔬菜植株，可诱导蔬菜产生抗病、抗低温、抗旱的多重抗逆效果。

22、进一步地，所述蔬菜包括黄瓜、番茄、辣椒、白菜、生菜中的任意一种。

23、进一步地，所述施用方式为：在蔬菜幼苗期至初花期进行叶面喷施，每 7 天喷施1 次，连续喷施 2～3 次，每次喷施量以叶片正反面均匀湿润为宜。

24、进一步地，诱导抗病包括抗霜霉病、白粉病、灰霉病中的至少一种；诱导抗低温为增强蔬菜对 0～10℃低温胁迫的耐受性；诱导抗旱为增强蔬菜对土壤相对含水量 30%～40% 干旱胁迫的耐受性。（三）有益效果

25、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

26、1.定向酶解效率高：采用 α-1,6 - 内切葡聚糖酶与 β-1,3 - 葡聚糖酶复配的复合酶系，利用两种酶的底物特异性与协同作用，实现对葡聚糖链的定向剪切，葡聚六糖在酶解产物中占比可达 45% 以上，远高于单一酶解法的 20%～25%。

27、2.产物纯度高、收率高：结合纳滤预分离与凝胶色谱精制工艺，最终葡聚六糖纯度≥95%，总收率≥28%，显著优于传统工艺。

28、3.反应可控性强：通过 hplc 实时监测与分批加酶策略，精准控制酶解终点，有效避免水解过度导致六糖进一步降解为小分子寡糖。

29、4.应用效果显著：所制备的葡聚六糖在极低浓度下即可诱导多种蔬菜产生广谱抗逆性，对黄瓜霜霉病防效达 65% 以上，同时提升低温与干旱胁迫下的存活率 30% 以上，兼具抗病与抗非生物胁迫双重功效。

30、5.绿色环保：整个制备过程以生物酶解为核心，无强酸强碱与有毒试剂使用，废水排放少，符合绿色生产要求。

技术实现思路

1.一种定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求 1 所述的定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，其特征在于，步骤（2）中所述 α-1,6 - 内切葡聚糖酶来源于重组毕赤酵母表达的朱黄青霉葡聚糖酶，酶活≥500u/ml；所述 β-1,3 - 葡聚糖酶来源于黑曲霉，酶活≥200u/ml。

3.根据权利要求 1 所述的定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，其特征在于，步骤（2）中复合酶制剂采用分批添加方式，首次加入总酶量的 60%，反应 4h 后补加剩余 40%酶液。

4.根据权利要求 1 所述的定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，其特征在于，步骤（3）中所述葡聚六糖占比峰值判定标准为：酶解液中葡聚六糖质量占总可溶性糖质量的45% 以上，且葡聚七糖及以上组分占比低于 15%。

5.根据权利要求 1 所述的定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，其特征在于，步骤（4）中所述纳滤膜截留分子量为 300～500da，操作压力为 0.8～1.2mpa，操作温度为 30～40℃。

6.根据权利要求 1 所述的定向酶解制备高纯度葡聚六糖的方法，其特征在于，步骤（5）中所述凝胶过滤色谱填料为 sephadex g-15，上样量为柱床体积的 5%～10%，洗脱流速为 0.5～1.0 倍柱体积 / 小时。

7.根据权利要求 1～6 任一项所述方法制备的葡聚六糖，其特征在于，葡聚六糖纯度≥95%，总收率≥28%。

8.权利要求 7 所述葡聚六糖在诱导蔬菜抗逆中的用途，其特征在于，将葡聚六糖配制成浓度为 5～50μg/l 的水溶液，采用叶面喷施方式处理蔬菜植株，诱导蔬菜产生抗病、抗低温、抗旱的多重抗逆效果。

9.根据权利要求 8 所述的用途，其特征在于，所述蔬菜包括黄瓜、番茄、辣椒、白菜、生菜中的任意一种。

10.根据权利要求 8 所述的用途，其特征在于，所述施用方式为：在蔬菜幼苗期至初花期进行叶面喷施，每 7 天喷施 1 次，连续喷施 2～3 次。