一种用于递送溶瘤病毒的巨核细胞复合系统及其制备方法和用途

本发明属于生物，具体涉及一种用于递送溶瘤病毒的巨核细胞复合系统及其制备方法和用途。

背景技术：

1、肿瘤免疫治疗(cancer immunotherapy)是通过激活、增强或重建患者自身免疫系统功能，特异性识别和杀伤肿瘤细胞的治疗策略。该疗法革命性地改变了肿瘤治疗的理念，已经成为继手术治疗、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗手段，并在临床应用中取得了巨大的进步。

2、溶瘤病毒是一种新兴的肿瘤免疫治疗方法。其通过溶瘤病毒或溶瘤肽识别和裂解肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(icd)，有效增强肿瘤的免疫原性，从而激活机体抗肿瘤免疫反应的新型免疫治疗手段。相较于溶瘤病毒，溶瘤肽的自身免疫原性和制备成本更低，安全性更高。目前，全世界已有多种溶瘤病毒被批准用于临床，其中较为著名的两种是我国于2005年批准的5型腺病毒(ad5)h101和美国及欧洲批准的可用于瘤内和胸腹腔注射的t-vec病毒。

3、随着近些年来对溶瘤病毒抗肿瘤研究的深入，进一步促进了使用溶瘤病毒对肿瘤进行生物治疗的发展。溶瘤病毒需要通过合适的给药方式送入肿瘤组织，并在肿瘤组织内复制进而产生抗肿瘤效果。目前溶瘤病毒递送的主要方式为：1)经皮瘤内注射率；2)静脉注射；3)形成递送载体。但均存在较大问题；1)溶瘤病毒经皮瘤内注射给药虽然能够提高肿瘤部位的病毒浓度，但瘤内注射时病毒在肿瘤组织高度致密的间质组织和肿瘤微环境的高间质压力共同作用下，其渗透能力严重受限，治疗效果难以保证。此外，经皮瘤内注射给药往往需要使用超声、计算机断层扫描、核磁共振成像等技术辅助引导给药，其操作繁琐复杂，患者依从性不佳，并且操作同时存在出血、穿孔等风险，且费用昂贵。此外，对于原发性肺癌和绝大多数肿瘤产生的肺转移，由于多发以及深部微小肿瘤灶的存在，溶瘤病毒通过瘤内注射进行治疗的方式显得尤为困难。2)静脉注射递送是目前最为方便的递送方式，克服了瘤内注射所带来的实际操作困难和患者较差的依从性，并能够有效的将溶瘤病毒递送至全身各处，但静脉注射递送也存在明显缺点；首先，溶瘤病毒的静脉递送与其他药物的静脉递送一样，由注射部位到肿瘤部位的运输过程中，容易与全身其他组织脏器结合，造成严重的副反应，比如严重的脏器毒性和细胞因子释放综合征(crs)。此外，由于溶瘤病毒往往需要多次给药才能达到治疗目的，而多次给药易导致患者血清中产生大量病毒中和抗体及补体，抗体补体的中和作用以及人体外周循环系统中的巨噬细胞等免疫细胞对病毒的吞噬与清除作用将大大影响病毒静脉递送的长循环时间以及效率，进而影响疗效。

4、cn202310156570.9公开了红细胞负载溶瘤病毒静脉递送制剂的制备及其抗肿瘤应用，其使聚乙烯亚胺包裹的溶瘤病毒通过静电作用吸附在红细胞的表面，制得红细胞负载的溶瘤病毒悬液，然后经静脉注射递送溶瘤病毒达到抗肿瘤的作用。cn202310119997.1公开了靶向递送溶瘤病毒的工程细胞及其制备方法和应用，其通过快速液氮冷冻处理将溶瘤病毒(ov)预先感染装载于肿瘤细胞中，从而消除肿瘤细胞的致病性。然而，红细胞递送缺乏肿瘤靶向能力，且无法实现肿瘤响应性病毒药物的释放行为；肿瘤细胞递送缺乏肿瘤靶向能力，且无法实现肿瘤响应性病毒药物的释放行为。cn202411536235.2公开了基于血小板靶向溶瘤病毒递送制剂的制备方法和应用，其将溶瘤病毒和血小板共孵育，得到了包载溶瘤病毒的血小板。其公开选择溶瘤病毒滴度数和血小板之间的最佳比例为10:1，因此血小板能有效包载溶瘤病毒的量更低。究其原因是血小板缺乏细胞核，其细胞器结构相对简单，难以像有核细胞那样通过内吞作用主动吸收大颗粒药物进行胞质装载，使得药物的包载效率较低，限制了其在药物递送系统中的应用；另外，病毒通过受体介导的结合和内化，激活血小板，导致其功能异常。这些病毒引起的血小板活化不仅影响血小板的正常功能，还可能增加血栓形成的风险，进一步加重患者的病情。

5、因此，目前急需要一种能有效包载溶瘤病毒且不会激活血小板的递送系统。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于递送溶瘤病毒的巨核细胞复合系统及其制备方法和用途。

2、本发明的第一方面提供一种递送溶瘤病毒的巨核细胞复合系统，至少包括巨核细胞和溶瘤病毒，所述溶瘤病毒包载于所述巨核细胞内。

3、本发明的巨核细胞复合系统通过内吞作用将溶瘤病毒颗粒内化至巨核细胞内部，高效地摄取并包装溶瘤病毒，从而提高溶瘤病毒的载药量；当巨核细胞复合系统进入体内后能释放携带病毒的血小板。与直接用血小板包载溶瘤病毒相比，本发明的巨核细胞复合系统不仅解决了血小板包载溶瘤病毒时包载量低的问题，而且避免了溶瘤病毒与血小板膜表面受体的直接接触，从而防止因溶瘤病毒激活而导致血小板的正常功能受损。本发明的巨核细胞复合系统在体内可驻留在肺部，利用肺部血管的湍流微环境释放携带溶瘤病毒的血小板，在肺癌及肺转移治疗方面具有巨大优势，同时血小板能够靶向肿瘤新生血管和转移灶及肿瘤术后伤口，因而可以提高病毒的肿瘤靶向递送效率，抑制肿瘤转移和复发；此外，释放后的携带溶瘤病毒的血小板能够被肿瘤微环境中的adp等因子激活，实现肿瘤响应性的细胞药物释放。

4、巨核细胞(megakaryocyte)起源于骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，hsc)，后者向巨核细胞系定向增殖与分化，成熟为多倍体大细胞，随后历经前血小板(proplatelet)形成、裂解、释放血小板进入血液循环的过程。该过程大致分4个阶段：①hsc自我更新与分化；②hsc分化为巨核系祖细胞；③巨核系祖细胞分化、增殖生成成熟巨核细胞；④血小板的生成与释放。本技术中通过筛选在巨核细胞增殖生成成熟阶段进行包载病毒，一方面有效了利用了成熟巨核细胞为多倍体大细胞，核内空间大，可高效携带溶瘤病毒的优势，另一方面该阶段尚未生成血小板，避免了溶瘤病毒直接接触血小板而激活血小板而导致血小板功能受损，其后续进入体内后再释放血小板。

5、在某些实施方式中，所述巨核细胞为鼠源或人源巨核细胞。

6、在某些实施方式中，所述巨核细胞由前体细胞经培养后获得。所述前体细胞选自l8057细胞、骨髓细胞、胚胎干细胞、诱导多功能干细胞中的一种或多种。

7、在某些实施方式中，所述培养时间为3～6天。本技术通过筛选前体细胞培养的时间，在3～6天，已经有分化成熟的巨核细胞但不能释放血小板阶段，作为包载病毒的适宜时机。本技术培养的时间不能太长，也不能短。培养7天时，细胞开始大量产血小板，但此时血小板过度激活，不仅无法有效包载病毒，还可能带来血栓和炎症等副作用；也不能短，少于3天时，细胞可能尚未成熟到可以有效包载病毒的程度，同时也无法生成和释放足够的血小板。

8、在某些实施方式中，所述培养为25～40℃。优选的，为25、28、32、37、40℃。在某些实施方式中，培养时，采用的培养基为含fbs的rpmi 1640培养基。以培养基的总体积为基准计，所述fbs的浓度10～20v/v％。优选的，为10、12、15、18和20v/v％。

9、在某些实施方式中，培养时，还包括加入佛波酯pma。所述佛波酯pma的添加浓度200～400nm。优选的，为200、300、400nm。

10、在某些实施方式中，所述病毒选自溶瘤腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、新城病毒、细小病毒、水疱性口炎病毒、呼肠病毒和脊髓灰质炎病毒中的一种或多种。

11、在某些具体的实施方式中，所述溶瘤病毒选自dna病毒和rna病毒中的一种或两种。

12、在某些更具体的实施方式中，所述溶瘤病毒为dna病毒。优选的，为5型溶瘤腺病毒。

13、在某些实施方式中，所述巨核细胞复合系统的载药量为2.5×106细胞装载2.2×108～8×108pfu病毒。本技术载药量是采用核酸分离试剂盒对巨核细胞复合系统进行分离提取，通过qpcr实验对对提取的溶瘤病毒的dna定量获得。

14、本发明的第二方面保护如上文所述巨核细胞复合系统的制备方法，包括如下步骤：

15、溶瘤病毒和巨核细胞共孵育，得到所述巨核细胞复合系统。

16、在某些实施方式中，所述共孵育的温度为25～40℃，也可以为25～36℃，也可以为35～40℃，也以为25、30、33、36、37、38、40℃。

17、在某些实施方式中，所述共孵育的时间为0.5～4小时，也可以为0.5～2.8小时，也可以为2.5～4小时，也以为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4小时。

18、在某些实施方式中，所述溶瘤病毒和巨核细胞的感染复数moi值为100～800。感染复数moi是指在感染实验中，病毒颗粒与宿主细胞的比例，也即病毒颗粒数量与宿主细胞数量的比值。

19、在某些实施方式中，共孵育时，还包括加入聚凝胺或丙酮酸中的一种或两种。

20、在某些具体的实施方式中，所述聚凝胺的添加浓度为2～10μg/ml，也可以为2～6μg/ml，也可以为5～10μg/ml，也可以为2、5、7、10、13、15、18、20μg/ml。本技术发现巨核细胞和病毒共孵育中添加聚凝胺能提高巨核细胞对病毒的包载量，提高了2.3倍以上；也对聚凝胺的添加浓度进行了研究，聚凝胺的添加浓度太高如20μg/ml时会导致巨核细胞裂解死亡，进而影响血小板的产生效率；而聚凝胺的添加浓度太低则病毒的载药量降低。

21、在某些具体的实施方式中，所述丙酮酸的添加浓度为400～600μg/ml，也可以为400～480μg/ml，也可以为450～600μg/ml，也可以为400、420、450、480、520、550、580、600μg/ml。本技术偶然发现加入聚凝胺和丙酮酸的组合能提高溶瘤病毒的包载量，与单独聚凝胺相比，提高了1.5倍左右。

22、在某些实施方式中，还包括洗涤和离心，获得所述复合系统。

23、在某些具体的实施方式中，洗涤时，采用pbs或dpbs洗涤。

24、在某些具体的实施方式中，所述离心的条件为100g离心5分钟。

25、在某些具体的实施方式中，所述离心的次数为至少1次，如2次、3次、4次。本领域技术人员可以在不影响巨核细胞下，选择适宜的离心次数。

26、本发明的第三方面保护一种复合药物，包括如上文所述巨核细胞复合系统和免疫检查点抑制剂。本技术发现巨核细胞复合系统和免疫检查点抑制剂联合给药后具有协同作用，增加治疗效果，提高免疫细胞数量，有效抑制肿瘤扩散。

27、在某些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为apdl1抗体。

28、本发明的第四方面保护如上文所述巨核细胞复合系统或如上文所述复合药物在制备在抑制肿瘤生长和/或转移的药物中的用途。

29、在某些实施方式中，所述肿瘤选自肺癌、结直肠癌、黑色素瘤和乳腺癌中的一种或多种。

30、在某些具体的实施方式中，所述肿瘤为肺癌。

31、本发明的第五方面保护巨核细胞作为药物递送载体的用途。优选的，作为递送载体在递送溶瘤病毒中的用途。本发明首次提出采用巨核细胞包载溶瘤病毒，其与常规采用的红细胞、血小板或肿瘤细胞作为递送载体相比，其能更加靶向肺部并在肺部蓄积，有效抗肺癌、肺癌转移、复发或扩散。

32、本发明具有以下有益效果：

33、1)本发明的用于递送病毒的巨核细胞复合系统采用巨核细胞包载溶瘤病毒，不仅对溶瘤病毒具有高包载量，而且能靶向细胞并释放出携带溶瘤病毒的血小板，解决无核血小板难以主动摄取溶瘤颗粒进行胞质装载的问题，同时也克服了血小板和溶瘤病毒接触导致血小板激活，而引发血栓、炎症等的问题。

34、2)本发明的用于递送溶瘤病毒的巨核细胞复合系统能有效靶向肿瘤细胞，并在肿瘤部位释放携带病毒的血小板，在体内和体外均可有效应用。

35、3)施用本发明的递送溶瘤病毒的巨核细胞复合系统后，小鼠的肿瘤和肺部转移被显著抑制。

36、4)本发明的递用于递送病毒的巨核细胞复合系统具有良好的血液相容性和生物相容性，安全性较佳。

37、5)本发明的用于递送病毒的巨核细胞复合系统能保护病毒免受中和抗体的影响。

38、6)本发明的用于递送病毒的巨核细胞复合系统和免疫检查点抑制剂协同能有效地抑制了肿瘤的转移灶的生长，提高了治疗效果，提高免疫细胞数量，有效抑制肿瘤扩散。