用于在灌流装置中培养细胞的可拆卸模块的制作方法

本发明涉及适用于灌流细胞培养装置的细胞培养插件。优选地，该插件适用于多孔细胞培养板。

背景技术：

1、细胞培养插件与孔板结合使用，用于各种细胞类型的生长和分化。对于某些应用而言，使灌流式培养基在培养孔内循环可能是有益的，这可以在补充培养基的同时移除细胞废物和已耗竭的培养基，并且还提供流体剪切应力作为对细胞的机械刺激。例如，可以实施该过程以研究细胞对药物的反应，或研究细胞或组织的代谢。能够将培养的细胞从孔中取出以（例如，通过显微镜检查）进行分析也可能是有利的。本发明旨在提供一种简单且高效的方法，以在允许这种取出的灌流细胞培养系统中培养细胞。本发明还提供了一种易于操纵模块的方法，当这些模块用于需要在多孔细胞培养板内同时研究大量条件或同时对同一条件进行多次重复的应用时，该方法有助于模块的使用和移除。

技术实现思路

1、根据本发明的一个方面，提供了一种细胞培养插件，其包括：

2、大致圆柱形的保持环，其用于将插件保持在细胞培养孔中，并具有由中央孔形成的上开口和下开口，该中央孔具有阶梯状轮廓，形成与下开口间隔开的孔的较窄部分；

3、细胞支架；

4、过滤器；以及

5、压环，其尺寸和形状适于被容纳在保持环的下开口内；其中

6、细胞支架和过滤器被容纳在保持环的下开口内，细胞支架暴露于保持环的上开口，并且其中，压环将细胞支架和过滤器保持在保持环内，抵靠孔的较窄部分。

7、这种构造允许该插件容易地用于静态或灌流细胞培养。具体地，支架和过滤器可以从下开口放入孔内，然后插入压环，以便将支架和过滤器抵靠于孔的较窄部分。可以将细胞接种到细胞支架中，并将模块用于静态细胞培养。也可以将细胞接种到细胞支架中，并使培养基最初从插件的上开口向下开口灌流通过。这允许细胞生长并附着至支架，同时过滤器确保细胞保持在与支架相邻的位置，从而增加附着的停留时间。一旦细胞附着并沉降在支架上，灌流可以沿任一循环方向继续进行。保持环可以在任何时刻移除，以允许在培养孔外对细胞进行分析。对细胞的分析也可以在不移除保持环的情况下通过其他方式进行，例如通过评估所取样培养基中的生物标志物来进行。

8、细胞支架、过滤器和压环各自优选地被构造成具有与孔相适配的形状。通常，这些形状将是圆形的，但是在一些实施例中，如果需要，可以在每个部件中设置不对称结构，以允许实现特定的对准。

9、优选地，保持环被构造成提供与细胞培养孔的过盈配合。在一些实施例中，通过在保持环的外部设置螺纹来实现这种配合。保持环可以被推入或旋入细胞培养孔中，以便与培养孔的内壁接合，并通过反向动作进行移除。在其他实施例中，肋条或其他突起可以设置在保持环的外部上。保持环可以由刚性生物相容性塑料材料制成。

10、优选地，保持环在下开口处包括成形轮廓，以与设置在压环上的相应轮廓接合。例如，下开口可以包括定位部或凹口，这些定位部或凹口可以与压环上的相应突起接合，如下文所述。保持环的其余部分可以被容纳在保持环的孔中。

11、在优选实施例中，孔的阶梯状轮廓形成孔的较窄中央部分，并且邻近上开口和下开口的部分较宽。该孔可以提供分别面向上开口和下开口的肩部。这些肩部具有多种用途。朝下的肩部形成孔的一部分，细胞支架和过滤器可以被压环抵靠在该部分上，并在使用插件时将细胞支架和过滤器固定就位。朝上的肩部形成不培养细胞的孔的一部分，并且可以用作（例如，通过移液管）从插件添加或移除细胞培养基的凸缘，从而降低干扰细胞或使细胞从细胞支架脱离的风险。

12、优选地，细胞支架包括延伸贯穿自身的孔隙或其他开口；这些孔隙提供了可供细胞在细胞培养期间沉降和附着的区域。孔隙可以以大致三角形的重复图案设置，这提供了相对高的孔隙密度。在优选的实施例中，细胞支架在外围或边缘区域不具有孔隙。在使用中，这些区域将与保持环和/或压环的孔接合，因此无孔设计提供了针对这些部件改进的密封。该布置还具有将细胞培养基的流动限制在支架的具有孔隙的区域的优点。孔隙优选为圆柱形。

13、在优选的实施例中，细胞支架由生物相容性（例如，生物惰性）聚合物制成。优选地，聚合物是聚苯乙烯。细胞支架可以涂覆有合适的细胞外基质材料，以增强细胞附着。支架优选地涂覆有胶原，但也可以使用其他材料。

14、过滤器的孔径被选择为使细胞保留在支架侧，同时允许培养基通过。因此，具体尺寸将取决于应用，但典型的孔径可以为例如0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10 μm。优选的孔径为5 μm。

15、过滤器可以由任何合适的材料制成，但聚合物材料是优选的；材料例如尼龙、纤维素、聚乙烯、聚四氟乙烯（ptfe）或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，pvdf）。pvdf（聚偏二氟乙烯）是最优选的。过滤器通常是非织造的，并且可以是例如电纺聚合物纤维或径迹蚀刻膜。

16、在优选实施例中，过滤器未与细胞支架结合或以其他方式粘附，而是简单地由压环保持。然而，在某些实施例中，过滤器可以结合到细胞支架上，以为过滤器提供额外的支撑；这种结合应该以尽量降低对过滤器和支架造成潜在损害的方式进行，并且这种结合与细胞培养是生物相容的。

17、在一些实施例中，过滤器可以包括附加的支撑材料；当过滤器相对较薄时（例如，小于0.3mm、0.25mm、0.2mm、0.15mm或0.1mm），这可能特别有用。支撑材料也可以是任何合适的材料，但优选是不起过滤作用的穿孔片状聚合物材料，以提供支撑而不妨碍过滤。

18、压环优选地呈大致圆柱形，但如上所述，压环可以包括与保持环接合的肋条或突起。优选地，压环和保持环以不可旋转的关系接合；这确保了当旋转插件时（例如，将其插入细胞培养孔或从细胞培养孔中取出），插件作为一个整体保持在相同的相对位置。压环可以进一步或可替代地包括一条或多条（优选至少三条）挤压肋条，这些挤压肋条被设计成与保持环的内表面形成过盈配合。这些挤压肋条可以是与保持环中的定位部相匹配的突起的补充。在一些实施例中，除了在压环上设置这种肋条之外，或者作为其替代方案，挤压肋条可以设置在保持环上。

19、压环优选地包括一个或多个内部肋条，以为支架和过滤器提供支撑。在优选实施例中，压环可以包括至少三条径向内部肋条。

20、压环优选地由可变形材料制成，以允许其紧密地置于保持环中。优选的材料是聚丙烯。

21、优选地，细胞培养插件还包括细胞。在一个优选实施例中，细胞是哺乳动物细胞，优选为人类细胞，更优选为肝细胞。

22、本发明的另一方面提供了一种细胞培养系统，其包括多孔细胞培养板和一个或多个如本文所述的插件。

23、本发明的另一方面提供了用于组装如本文所述的细胞培养插件的套件。

1.一种细胞培养插件，其包括：

2.根据权利要求1所述的细胞培养插件，其中，所述细胞支架、所述过滤器以及所述压环各自被配置成具有与所述孔相适配的形状。

3.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述保持环被配置成提供与细胞培养孔的过盈配合。

4.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，在所述保持环的外部部分上设置螺纹。

5.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述保持环在所述下开口处包括成形轮廓，以与设置在所述压环上的相应轮廓接合。

6.根据权利要求5所述的细胞培养插件，其中，所述保持环的下开口包括与所述压环上的相应凸耳接合的定位部或凹口。

7.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述孔的阶梯状轮廓形成所述孔的较窄中央部分，并且邻近所述上开口和所述下开口的部分较宽。

8.根据权利要求7所述的细胞培养插件，其中，所述孔提供分别面向所述上开口和所述下开口的肩部。

9.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述细胞支架包含延伸贯穿自身的孔隙或其它开口。

10.根据权利要求9所述的细胞培养插件，其中，所述细胞支架在外围或边缘区域不具有孔隙。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的细胞培养插件，其中，所述孔隙是圆柱形的。

12.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述细胞支架由生物相容性聚合物制成。

13.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述细胞支架涂覆有细胞外基质材料。

14.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述过滤器未与所述细胞支架结合或以其他方式粘附。

15.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述压环和所述保持环以不可旋转的关系接合。

16.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述压环包括一个或多个挤压肋条，所述挤压肋条被设计成与所述保持环的内表面形成过盈配合。

17.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述压环包括一个或多个内部肋条以向所述支架和所述过滤器提供支撑。

18.根据权利要求17所述的细胞培养插件，其中，所述压环包括至少三条径向内部肋条。

19.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述压环由可变形材料制成。

20.根据任一前述权利要求所述的细胞培养插件，其中，所述细胞培养插件还包括细胞。

21.根据权利要求20所述的细胞培养插件，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。

22.一种细胞培养系统，其包括多孔细胞培养板和一个或多个根据任一前述权利要求所述的插件。

23.一种套件，其用于组装根据权利要求1至21中任一项所述的细胞培养插件。