一种高纯度血促性素规模化生产方法与流程

本发明属于孕马血清促性腺激素生产，具体涉及一种高纯度血促性素规模化生产方法。

背景技术：

1、孕马血清促性腺激素（简称pmsg）是孕中母马尿囊绒毛膜细胞分泌的糖蛋白类促性腺激素。pmsg具有类似促卵泡素（fsh）和促黄体素（lh）的双重活性，但以fsh的作用为主，具有明显的促卵泡发育作用；同时，也有一定的促排卵和黄体形成的功能，对雄性动物具有促使精细管发育和性细胞分化的功能。实践上，pmsg可以调控母畜同期发情，实现可控同步批次化生产，并缩短配种时间、降低不孕概率、提高繁殖效率。目前，pmsg已经广泛应用于动物的诱导发情、同期发情，超数排卵或增加排卵率；同时对卵巢发育不全或雄性生精能力衰退等也有良好的疗效。

2、应用范围的扩大和规模化养殖的普及导致市场对pmsg的需求量大幅上升。尽管国际和国内市场需求很大，但我国的pmsg生产工艺还很落后，基本上沿用传统的蛋白质分离技术，如中国专利cn207294655u公开了一种孕马血清促性腺激素的提取系统，提取方法为：孕马血清偏磷酸沉淀-加入硫酸铵-低浓度乙醇沉淀-高浓度乙醇沉淀-获得pmsg粗品，以及中国专利申请cn1872088a公开了一种兽用血促性素生产工艺及其产品，提取方法为：孕马血清稀释→加硫酸铵并调ph值为6.0-7.0→过滤后加偏磷酸沉淀→上清中空纤维浓缩→低浓度乙醇沉淀→上清高浓度乙醇沉淀→获得pmsg粗品。上述传统方法获得的产物均为pmsg粗品，效价较低，不足300iu/mg，国家药典标准≥100iu/mg，而欧洲药典标准为≥1000iu/mg，pmsg粗品的效价与欧洲药典标准相差甚远。纯度低的pmsg制品对受用动物也会产生一定危害，除此之外，上述提取方法还存在收率低、质量稳定性差等问题，规模化生产技术就更不尽人如意，无法满足要求，也严重影响到经济效益和社会效益的实现。

3、中国专利cn110950948b公开了一种高纯度孕马血清促性腺激素的制备工艺，但是其依然存在以下缺点：1、工艺稳定性差：原工艺粗品提取过程用到偏磷酸沉淀，该方法较为传统，至今没有国家标准。各生产企业标准不一、质量层次不齐，会对工艺造成影响。同时该物料属于小众物料，稳定性较差，难以应用于放大生产。2、工艺设备效率低。原工艺所用设备为普通离心机，分离效率低下，不利于生产放大。3、工艺周期较长。原工艺的设备效率低、物料体系大导致工艺周期长，费时费力。4、工艺物料消耗较多。原工艺醇沉步骤体系较大，从而增大了后续工艺的物料投入。5、产品收率和单位效价（纯度）相对较低，产品质量稳定性较差。

4、现有技术的缺点如下：1、工艺稳定性差：原工艺初级品提取过程用到偏磷酸沉淀，该方法较为传统，偏磷酸属于小众化学物料，至今没有国家标准。各生产企业标准不一、质量层次不齐，会对工艺造成影响。同时该物料属于小众物料，稳定性较差，难以应用于放大生产。2、工艺设备效率低。原工艺所用设备为挂杯式普通离心机，分离效率低下，不利于生产放大。产能放大后需要购买20台离心机同步运行、效率极低、安全风险增加。3、工艺周期较长。原工艺步骤烦琐，大部分采用传统化学分离方法，且需要重复操作。加之设备效率低、物料体系大导致工艺周期长，费时费力。4、产品纯度虽符合中国药典标准（≥2000iu/mg），但纯度仍然较低，不能满足欧美高端市场和定制化客户。5、产品溶解性虽符合中国药典标准，但与欧美标准比较（澄清）还有差距。6、大规模生产收率略低（60%）。

5、为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种高纯度血促性素规模化生产方法。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种可稳定、高效、规模化地制备高纯度孕马血清促性腺激素的方法。该方法应具备工艺稳定性好、生产效率高、生产周期短、物料消耗低、产品纯度和收率高等优点，尤其适用于满足国际高端市场的需求。

2、为实现上述发明目的，本发明提供了一种高纯度血促性素规模化生产方法，包括以下步骤：

3、步骤一、以六偏磷酸钠溶液作为沉淀剂对孕马血清进行酸沉处理，酸沉处理完成后，经固液分离后收集酸沉上清液；

4、步骤二、对所述酸沉上清液进行超滤浓缩，得到超滤浓缩液；

5、步骤三、对所述超滤浓缩液依次进行一级醇沉和二级醇沉，经固液分离后收集醇沉沉淀物，得到血促性素初级品；

6、步骤四、将所述血促性素初级品溶解后依次进行苯甲酸吸附处理、固液分离处理和解吸附处理，得到血促性素中间体；

7、步骤五、将所述血促性素中间体依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析和亲和层析，得到亲和层析洗脱液；

8、步骤六、对亲和层析洗脱液进行精沉处理，收集沉淀物，得到高纯度血促性素。

9、优选地，步骤一中，所述酸沉处理，具体包括：将六偏磷酸钠溶液以喷雾的形式加入到孕马血清中，加液过程中对孕马血清进行持续搅拌，六偏磷酸钠溶液的加入量为使得孕马血清的ph值达到3.4±0.2，加液时长为3-3.5h；

10、其中，六偏磷酸钠溶液为2wt%-4wt%、ph值为1.2-1.8的六偏磷酸钠水溶液；

11、所述固液分离，具体包括：先采用板框压滤机进行过滤，再进行顶洗，滤液与顶洗液合并，作为酸沉上清液。

12、优选地，所述六偏磷酸钠溶液为3wt%、ph值为1.5的六偏磷酸钠水溶液。

13、优选地，采用板框压滤机进行过滤时，先预先安装好支撑过滤纸板，并用ph值为3.4的六偏磷酸钠水溶液润洗后开始过滤，过滤结束后，用ph值为3.4的六偏磷酸钠溶液顶洗，顶洗液并入滤液作为酸沉上清液，泵入反应釜中。

14、优选地，所述ph值为3.4的六偏磷酸钠水溶液为通过向3wt%、ph值为1.5的六偏磷酸钠水溶液中加入去离子水进行稀释，至六偏磷酸钠水溶液的ph值为3.4。

15、优选地，顶洗结束后，打开压缩空气吹扫出残余料液后卸料称量固渣作为固废处理。

16、优选地，步骤二中，所述超滤浓缩使用的超滤膜包为截留分子量30kd的singlepass tff（单次通过的薄膜蒸发器）膜包，材质为pes。

17、优选地，所述single pass tff在进行高浓度浓缩时，具有更长的流路，可以采用降低进口流速来进一步提高浓缩倍数。single pass tff因为采用单向流的流路设计，大大降低了产品往复循环剪切力带来的影响，并且进口泵速也显著低于传统tff，进一步降低了系统剪切力。

18、优选地，步骤二中，所述超滤浓缩，具体包括：先调节酸沉上清液的ph值为7.0±0.2，再采用1μm+0.45μm微滤器进行预过滤，预过滤完成后，进行顶洗，滤液与顶洗液合并，经超滤浓缩处理浓缩至孕马血清投料量的1/4-1/6倍量后，用0.05mol/l乙酸钠缓冲液洗滤，再经超滤浓缩处理浓缩至孕马血清投料量的1/10倍量，收集浓缩液；用0.05mol/l乙酸钠缓冲液顶洗浓缩，收集顶洗浓缩液并入浓缩液，定量至孕马血清投料量的1/7，完成超滤浓缩。

19、优选地，所述超滤浓缩的具体操作为：开启反应釜的搅拌与冷媒，滴加5mol/l氢氧化钠水溶液调节料液的ph值为7.0±0.2；将料液泵入1μm+0.45μm微滤器进行预过滤，过滤后用去离子水顶洗反应釜罐体及微滤器，顶洗液并入滤液并转移至超滤浓缩罐中；开启超滤设备进行超滤浓缩处理，控制运转频率为20-50hz、进口端压力≤0.15mpa、料液温度为2-8℃；料液浓缩至孕马血清投料量的1/4-1/6倍量时用ph值为7.0±0.2的0.05mol/l乙酸钠缓冲液洗滤，重复3次，洗滤结束后，浓缩至孕马血清投料量的1/10倍量，关闭超滤设备，通过底端排放口收集浓缩液，用ph值为7.0±0.2的0.05mol/l乙酸钠缓冲液顶洗浓缩2次，收集顶洗浓缩液并入浓缩液，定量至孕马血清投料量的1/7。

20、优选地，步骤三中，所述一级醇沉为向超滤浓缩液中加入乙醇至乙醇的终浓度为45v/v%-55v/v%，调节ph值为5.5±0.5；所述二级醇沉为收集一级醇沉上清液后加入乙醇至乙醇的终浓度75v/v%-85v/v%。

21、优选地，所述一级醇沉的操作为：将超滤浓缩液转入反应釜，开启搅拌及冷媒，向反应釜中滴加冷乙醇（≤-10℃），控制料液温度≤8℃，冷乙醇的滴加时间≥1.5h，滴加完毕后，用乙醇-盐酸混合溶液（乙醇的体积浓度为50%，盐酸的浓度为4mol/l）调节ph值为6.0±0.1，静置存放12-36h。

22、优选地，所述二级醇沉的操作为：开启反应釜搅拌及冷媒，向反应釜中滴加冷乙醇（≤-10℃），控制料液温度≤8℃，冷乙醇的滴加时间≥1.5h，滴加完毕后，静置存放12-36h。

23、优选地，步骤三中，所述一级醇沉后的固液分离采用平板沉降离心机进行离心分离，离心转速为1500-2000r/min，离心时间为20-40min。

24、优选地，离心转速为1800r/min、离心时间为25min。

25、优选地，所述一级醇沉后的固液分离操作为：从反应釜底端放出料液，用平板沉降离心机进行离心分离，收集上清液，离心沉淀物用乙醇-乙酸钠混合溶液（乙醇的体积浓度为50%，乙酸钠的浓度为0.23mol/l，ph值为5.5±0.5）搅拌均匀，再离心分离，收集清液并入上清液，转入反应釜中，离心沉淀物作为固废处理。

26、优选地，所述二级醇沉后的固液分离操作为：打开反应釜虹吸阀，将上清液转至中空纤维浓缩罐，启动0.65μm中空纤维系统浓缩至最小量（即启动0.65μm中空纤维系统进行减体积浓缩，直至料液浓缩至中空纤维柱无法继续循环的最小残留体积，此时膜包内料液流动受阻，系统压力自然归零），停止浓缩，将浓缩产物并入反应釜的剩余料液中；离心，收集离心沉淀物，离心沉淀物经无水乙醇洗涤2次后，真空干燥，得到血促性素初级品。

27、优选地，步骤四中，所述苯甲酸吸附，具体包括：将血促性素初级品溶解于0.02mol/l乙酸钠水溶液中，加入苯甲酸钠溶液，用盐酸调节ph值为4.0±0.1进行吸附；所述解吸附包括：收集苯甲酸吸附后的固形物，加入冷乙醇溶解，静置解吸附后，离心，收集离心沉淀物，离心沉淀物经乙醇洗涤，得到血促性素中间体。

28、优选地，所述苯甲酸吸附的具体操作为：开启反应釜搅拌及冷媒，将血促性素初级品投入至ph值为7.0±0.2的0.02mol/l乙酸钠水溶液中，乙酸钠水溶液的用量为血促性素初级品干重的250倍，搅拌至完全溶解后（搅拌时间≥1.5h），再加入配制好的25wt%-35wt%的苯甲酸钠溶液，苯甲酸钠水溶液的用量为血促性素初级品干重的200倍，搅拌20min后，滴加4mol/l盐酸溶液调节ph值为4.0±0.1，滴加时间≥3.5h，继续搅拌1h，完成吸附。

29、优选地，步骤四中，所述苯甲酸吸附后的固液分离采用wyzl型过滤机。

30、优选地，所述wyzl型过滤机为浊式过滤器与wyyl型平板过滤器联用。其操作方式为：苯甲酸吸附处理后的料液经搅拌后，由气动泵进料至浊式过滤器过滤，滤布采用300目，滤饼厚度控制在30-35mm，过滤完成后，用压缩空气顶至最小体积（即引入压缩空气顶洗过滤系统，将过滤介质及管路中的滞留液强制排出，吹顶至滤液出口仅见断续气泡、无液相流出为止），收集顶洗残液，残渣用压缩空气吹干后卸料，收集固体；顶洗残液进入平板过滤器后过滤，滤布采用300目，滤饼厚度控制在20mm以内，收集固体；将浊式过滤器收集到固体和平板过滤器收集到固体合并，用乙醇溶解、冲洗后收集，移入下一反应釜。

31、优选地，所述解吸附的操作为：开启搅拌及冷媒，加入血促性素初级品干重800-830倍的冷乙醇（≤-10℃），继续搅拌至固体完全溶解后静置存放24-72h；打开反应釜虹吸阀，将上清液转至中空纤维浓缩罐，启动0.65μm中空纤维系统浓缩至最小量，浓缩产物并入反应釜剩余料液，离心，收集离心沉淀物（转速3800r/min、时间15min），向离心沉淀物中加入血促性素初级品干重80-85倍的乙醇搅拌均匀后，离心分离，收集离心沉淀物，得到血促性素中间体。

32、进一步地，对所得血促性素中间体进行称重并记录，0℃以下保存。

33、优选地，步骤五中，所述阳离子交换层析的填料为cm beads 6ff，所述阴离子交换层析的填料为capto deae（弱阴离子交换填料，离子交换基团为-n+h(ch2ch3)2），所述亲和层析的填料为astrea bio。

34、优选地，所述cm beads 6ff是一种强阳离子交换填料，离子交换基团为-o-ch2-coo-，性能见表1：

35、表1

36、

37、优选地，所述capto deae是一种弱阴离子交换填料，离子交换基团为-n+h(ch2ch3)2，性能见表2：

38、表2

39、

40、优选地，所述astrea bio亲和填料信息见表3：

41、表3

42、

43、优选地，步骤五中，所述阳离子交换层析，具体包括：将血促性素中间体溶解于ph值为7.0±0.2的0.03mol/l乙酸钠水溶液中上样，用0.2-0.4mol/l氯化钠水溶液洗脱，收集目标蛋白洗脱液；所述阴离子交换层析为：将阳离子层析洗脱液用30kd超滤膜包浓缩脱盐至电导率≤3000μs/cm后上样于capto deae层析柱，0.03mol/l乙酸铵水溶液淋洗，0.2-0.4mol/l氯化钠水溶液洗脱，收集目标蛋白洗脱液；所述亲和层析为：将阴离子层析洗脱液上样于astrea bio层析柱，用ph值为7-8的乙酸铵-氯化钠-磷酸钠缓冲液洗脱，收集目标蛋白洗脱液，得到亲和层析洗脱液；

44、层析柱用1mol/l氢氧化钠水溶液淋洗；

45、其中，乙酸铵-氯化钠-磷酸钠缓冲液中，乙酸铵的浓度为0.5mol/l，氯化钠的浓度为0.1mol/l，磷酸钠的浓度为0.05mol/l。

46、优选地，所述阳离子交换层析的具体操作为：在溶解罐中加入ph值为7.0±0.2的0.03mol/l乙酸钠水溶液，控制溶液温度2-8℃，投入血促性素中间体，血促性素中间体的质量为乙酸钠水溶液质量的2%，搅拌1-1.5h，得到血促性素中间体溶液；加入去离子水调节血促性素中间体溶液的电导率与乙酸钠水溶液的电导率相近（±100μs/cm），用冰乙酸调节血促性素中间体溶液的ph值为7.0±0.2；采用cm beads 6ff阳离子交换填料上样，用0.2-0.4mol/l氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱液至接收罐，全程uv280检测（即全程在紫外检测波长280nm处监测洗脱液的吸光度值）。

47、优选地，所述阴离子交换层析的操作为：阳离子层析洗脱液用pes材质、30kd切向流超滤膜包浓缩脱盐，直至回流端电导≤3000μs/cm，停止超滤；料液采用capto deae阴离子交换填料上样，用0.03mol/l乙酸铵水溶液淋洗，0.2-0.4mol/l氯化钠水溶液，洗脱液至接收罐，全程uv280检测。

48、优选地，所述亲和层析的操作为：阴离子层析洗脱液用astrea bio亲和填料上样，用乙酸铵-氯化钠-磷酸钠缓冲液（乙酸铵的浓度为0.5mol/l，氯化钠的浓度为0.1mol/l，磷酸钠的浓度为0.05mol/l，ph值在7-8之间）洗脱，收集洗脱液至接收罐，全程uv280检测。

49、进一步地，步骤六中，所述精沉处理为向亲和层析洗脱液中加入的冷乙醇，静置沉淀。

50、优选地，所述精沉处理的具体操作为：开启反应釜搅拌及冷媒，滴加亲和层析洗脱液5倍体积的冷乙醇（≤-10℃），控制料液温度≤8℃，滴加时间≥1.5h，滴加完毕后，静置存放12-36h。

51、优选地，所述精沉后收集沉淀物的具体操作为：打开反应釜的虹吸阀，将上清液转至中空纤维浓缩罐，启动0.65μm中空纤维系统浓缩至最小量，浓缩产物并入反应釜剩余料液；离心，收集离心沉淀物，离心沉淀物经无水乙醇洗涤2次后，真空干燥，得到血促性素。

52、进一步地，所述孕马血清促性腺激素的生物效价≥6500iu/mg。

53、进一步地，所述制备方法的总收率达到60%以上。

54、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

55、1、提高工艺稳定性及利于产能放大：本方法筛选出一种新的沉淀剂——六偏磷酸钠，用六偏磷酸钠替代偏磷酸对孕马血清进行酸沉处理；六偏磷酸钠属于大宗物料，有国家标准，质量稳定、标准统一、可大规模提供，不受供应商限制，有利于血促性素生产规模放大，同时价格为偏磷酸的一半，可大幅降低生产成本。

56、2、采用新设备提升生产效率：本方法在血促性素初级品制备过程中，用平板沉降离心机替代传统的挂杯式离心机（一级醇沉后的固液分离）；在血促性素中间体制备过程中用筒式过滤器（wyzl型过滤机）代替传统的滤槽过滤（苯甲酸吸附后的固液分离），减少物料与环境接触时间，降低产品污染概率，提升了料液的处理效率，减少了工作强度，降低了生产风险。

57、3、缩短生产工艺周期：本方法增加新的层析工艺，将血促性素中间体依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析和亲和层析，替代传统化学提纯方法，能够有效提高产物的纯度，大幅缩短了工艺周期。

58、4、本发明首次利用30kd的single pass tff膜包超滤系统对醇沉料液进一步浓缩，能够更有效地去除杂蛋白等杂质，相较于普通tff膜包，对目标蛋白的截留和回收效果更好，目标蛋白损失更少，初级品效价显著高于普通tff膜包，产品纯度更高；能够大幅度减少后续工艺的料液体积，降低乙醇等物料消耗。

59、5、本方法独创的新工艺，首次将规模化生产的产品纯度提升到了新高度（生物效价≥6500iu/mg），满足欧美高端市场和定制化客户，且提升了药品质量标准，其中溶解性达到澄清，符合欧美市场药品准入要求。

60、6、本方法独创的生产工艺，在提升药品质量、提升产品纯度、降低生产成本的同时兼顾产品收率，生产数据表明：规模化生产得到的血促性素收率总收率≥60%，进一步提高了企业竞争力。

61、7、本发明规模化生产方法提高了产品收率、单位效价（纯度）及缩短了制备周期，产品稳定性更好，更安全，相比中国专利cn110950948b，可提高产品收率，缩短工艺周期，减少物料消耗，大幅提高纯度，可获得生物效价≥6500iu/mg的高纯度孕马血清促性腺激素，完全适用于大规模的工业生产，对企业经济效益产生了积极影响。