一种柑橘木虱dsRNA纳米农药的低成本规模化生产工艺
本发明属于农业生物，具体涉及一种靶向柑橘木虱的双链 rna (dsrna)纳米农药的低成本规模化生产工艺。
背景技术：
1、柑橘黄龙病 (huanglongbing, hlb) 是由 "候选韧皮部杆菌亚洲种"(candidatus liberibacter asiaticus, clas) 引起的柑橘毁灭性病害，目前尚无有效治疗方法。亚洲柑橘木虱 (diaphorina citri kuwayama) 是柑橘黄龙病的唯一传播媒介，因此控制柑橘木虱是防控黄龙病的关键措施。
2、传统化学农药防治柑橘木虱存在农药残留、环境污染、害虫抗药性等问题。rna 干扰 (rnai) 技术基于外源双链 rna 特异性降解同源 mrna，抑制害虫关键靶基因表达，从而干扰其生长繁殖，具有特异性强、环境安全性高、不易产生抗药性等优点，已成为农业害虫防治的新方向。
3、然而，dsrna 农药的商业化应用面临两大瓶颈：一是 dsrna 生产成本高，化学合成和体外转录试剂盒成本昂贵，难以满足大田应用需求；二是裸露的 dsrna 在田间易被紫外线、核酸酶降解，且难以穿透昆虫中肠细胞膜，递送效率低。
4、目前已有研究采用微生物发酵生产 dsrna，但普遍存在产量低、纯化工艺复杂、成本高等问题。同时，现有纳米载体如层状双金属氢氧化物、金属有机框架等制备工艺复杂、成本较高，不适合大规模生产。
5、因此，开发一种低成本、高效率、适合工业化大规模生产的柑橘木虱 dsrna 纳米农药生产工艺具有重要的现实意义和应用价值。 技术实现要素：
6、（一）解决的技术问题 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种柑橘木虱 dsrna 纳米农药的低成本规模化生产工艺，解决现有技术中 dsrna 生产成本高、纳米载体制备复杂、递送效率低等问题。（二）技术方案
7、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8、一种柑橘木虱 dsrna 纳米农药的低成本规模化生产工艺，包括以下步骤：
9、步骤 1：重组表达载体的构建
10、选择柑橘木虱关键基因作为靶标，所述关键基因为 dcsnf7 基因和 / 或 dciap5基因；
11、设计特异性引物，以柑橘木虱 cdna 为模板扩增靶基因片段；
12、将扩增得到的靶基因片段反向重复插入到携带双向 t7 启动子的 l4440 载体中，获得重组表达载体。
13、步骤 2：工程菌株的构建与活化
14、将重组表达载体转化至 rnase iii 缺陷型大肠杆菌 ht115 (de3) 感受态细胞中，获得工程菌株；
15、将工程菌株接种于含氨苄青霉素的 lb 固体培养基上，37℃培养 12-16h，挑取单菌落进行 pcr 验证；
16、将验证正确的单菌落接种于含氨苄青霉素的 lb 液体培养基中，37℃、200rpm 振荡培养 12-16h，作为种子液。
17、步骤 3：高密度发酵生产 dsrna
18、将种子液按 5%-10% 的接种量接种于 tb 发酵培养基中，37℃、200rpm 振荡培养；
19、当 od600 达到 0.6-0.8 时，加入终浓度为 4-8g/l 的乳糖进行诱导，继续培养12-16h；
20、发酵结束后，4℃、8000rpm 离心 10min 收集菌体。
21、步骤 4：dsrna 的低成本提取与纯化
22、将收集的菌体用 ste 缓冲液重悬，加入溶菌酶至终浓度为 1mg/ml，37℃孵育30min；
23、加入等体积的酚 - 氯仿 - 异戊醇 (25:24:1) 混合液，剧烈振荡 10min，4℃、12000rpm 离心 15min；
24、取上清液，加入 0.1 倍体积的 3m 醋酸钠 (ph5.2) 和 2 倍体积的无水乙醇，-20℃放置 30min；
25、4℃、12000rpm 离心 15min，弃上清，用 75% 乙醇洗涤沉淀 2 次，室温干燥后用无 rnase 水溶解；
26、加入 dnase i 和 rnase a，37℃孵育 30min，去除 dna 和单链 rna，获得纯化的dsrna。
27、步骤 5：壳聚糖纳米载体的低成本制备
28、将壳聚糖 (分子量 40-100kda，脱乙酰度 70-85%) 溶解于 1% 醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，制备成 1-2mg/ml 的壳聚糖溶液；
29、用 0.22μm 滤膜过滤除菌，得到壳聚糖纳米载体母液。
30、步骤 6：dsrna - 壳聚糖纳米复合物的制备
31、将纯化的 dsrna 溶液与壳聚糖纳米载体母液按质量比 1:(2-5) 混合，室温下轻轻搅拌 30min；
32、用 0.1m naoh 溶液调节 ph 至 5.5-6.0，继续搅拌 10min；
33、加入适量的蔗糖作为冻干保护剂，冷冻干燥后得到柑橘木虱 dsrna 纳米农药成品。
34、进一步地，步骤 1 中所述 dcsnf7 基因的核苷酸序列如 seq id no:1 所示，所述 dciap5 基因的核苷酸序列如 seq id no:2 所示。
35、进一步地，步骤 3 中所述 tb 发酵培养基的配方为：胰蛋白胨 12g/l，酵母提取物 24g/l，甘油 4ml/l，kh2po4 2.31g/l，k2hpo4 12.54g/l。
36、进一步地，步骤 3 中所述发酵过程采用补料分批发酵方式，当 od600 达到 2.0时，开始补加葡萄糖溶液，补糖速度为 1-2g/(l・h)，直至发酵结束。
37、进一步地，步骤 6 中所述 dsrna 与壳聚糖的质量比优选为 1:3。
38、进一步地，步骤 6 中所述蔗糖的终浓度为 5%-10%(w/v)。（三）有益效果
39、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
40、生产成本低：本发明采用大肠杆菌 ht115 (de3) 高密度发酵生产 dsrna，使用廉价的乳糖作为诱导剂替代昂贵的 iptg，采用 tb 培养基替代 lb 培养基，dsrna 产量可达80μg/ml 以上，生产成本降低至 0.3 美元 /g 以下，远低于现有技术水平。
41、工艺简单易规模化：本发明采用一步法制备壳聚糖纳米载体和 dsrna - 壳聚糖纳米复合物，无需复杂的化学反应和昂贵的设备，生产周期短，适合工业化大规模生产。
42、稳定性好、递送效率高：本发明制备的 dsrna - 壳聚糖纳米复合物平均粒径为200-300nm，zeta 电位为 + 20-+30mv，能有效保护 dsrna 免受紫外线和核酸酶降解，在柑橘木虱中肠碱性环境下可智能释放 dsrna，显著提高递送效率。
43、防治效果好、安全性高：本发明生产的柑橘木虱 dsrna 纳米农药对柑橘木虱若虫和成虫的致死率达 85% 以上，且对蜜蜂、瓢虫等非靶标生物安全，无农药残留，符合绿色农业发展要求。
技术实现思路