抗阿托品抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及抗阿托品抗体及其用途。

背景技术：

1、阿托品（atropine，atr）是一种抗胆碱性药物，为m受体阻断剂，该类药物有抑制腺体分泌、解除平滑肌痉挛、兴奋呼吸中枢、解除迷走神经对心脏的抑制等药理活性。数年来，研究者对于阿托品的研究基本停留在医学领域，对于其超过治疗剂量使用的危害及非法使用的监测鲜有报道。大量研究数据表明，过量摄入阿托品会诱发视力模糊、瞳孔扩张、口干、皮肤红肿、呕吐、心动过速等不良反应，严重情况下可致人死亡。部分不法商贩受利益驱使，利用阿托品可抑制腺体分泌的药理特性，人为造成牲畜口渴并大量饮水，以此非法增重。此类牲畜屠宰加工后，体内未完全代谢的阿托品会残留于肉制品中。消费者长期或过量摄入含阿托品残留的肉制品，易引发急性中毒及慢性蓄积性中毒，严重危害人体健康与饮食安全。因此，对成品肉类进行阿托品类生物碱含量的检测尤为重要。

2、目前常用的检测动物源性成品肉中阿托品残留的方法主要有分光光度法、高效液相色谱法和仪器联用法；分光光度法无需依赖精密仪器设备，具备操作简便、检测迅速的优势，但该方法检出下限偏高，不适用于食品中低浓度阿托品残留的痕量分析。而高效液相色谱法（hplc）和仪器联用法不仅检测仪器昂贵、分析耗时较长，同时对实验环境条件与操作人员专业水平均有较高要求。近年来，免疫学方法凭借操作简便、检测快速、灵敏度高、人员操作门槛低等优势，已成为兽药残留确证检测前大批量样品初筛的重要手段。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种抗阿托品抗体及其用途。

2、本发明第一方面提供一种抗阿托品抗体或其抗原结合片段，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段包括：

3、a1)具有如seq id no：2所示氨基酸序列的重链可变区（vh）中包括的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；和/或，具有如seq id no：4所示氨基酸序列的轻链可变区（vl）中包括的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3；或

4、a2)分别与如a1）中所示的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3相比具有一个或者多个氨基酸置换、缺失或添加的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；和/或，分别与如a1）中所示的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3相比具有一个或者多个氨基酸置换、缺失或添加的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3；

5、所述cdr根据kabat、chothia、imgt、contact、或abm编号系统定义。

6、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段包括：

7、b1)包括如下3个cdr的vh：具有seq id no: 5所示氨基酸序列的cdr-h1、具有seqid no: 6所示氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no: 7所示氨基酸序列的cdr-h3；和/或，包括如下3个cdr的vl：具有seq id no:8所示氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:9所示氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no: 10所示氨基酸序列的cdr-l3；或

8、b2)包括如下3个cdr的vh：分别与如b1）中所示的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3相比具有一个或者多个氨基酸置换、缺失或添加的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；和/或，包括如下3个cdr的vl：分别与如b1）中所示的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3相比具有一个或者多个氨基酸置换、缺失或添加的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3；

9、其中，所述cdr根据kabat编号系统定义。

10、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段的重链可变区还包括重链可变区的框架区。

11、在一些实施方式中，所述重链可变区的框架区包括来源于鼠、灵长目动物、牛、马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅的免疫球蛋白的重链可变区的框架区或其突变体。在一些实施方式中，所述重链可变区的框架区包括来源于小鼠、大鼠、狐猴、猕猴、黑猩猩或人的免疫球蛋白的重链可变区的框架区或其突变体。在一些实施方式中，所述重链可变区的框架区包括源于小鼠的免疫球蛋白的重链可变区的框架区或其突变体。

12、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段的轻链可变区还包括轻链可变区的框架区。

13、在一些实施方式中，所述轻链可变区的框架区包括来源于鼠、灵长目动物、牛、马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅的免疫球蛋白的轻链可变区的框架区或其突变体。在一些实施方式中，所述轻链可变区的框架区包括来源于小鼠、大鼠、狐猴、猕猴、黑猩猩或人的免疫球蛋白的轻链可变区的框架区或其突变体。在一些实施方式中，所述轻链可变区的框架区包括来源于小鼠的免疫球蛋白的轻链可变区的框架区或其突变体。

14、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段包括：

15、重链可变区（vh），其包括seq id no: 2所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列；和/或，轻链可变区（vl），其包括seq id no: 4所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。

16、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

17、在一些实施方式中，所述重链恒定区包括至少一部分来源于鼠、灵长目动物、牛、马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅的免疫球蛋白的重链恒定区或其突变体。在一些实施方式中，所述重链恒定区包括至少一部分来源于小鼠、大鼠、狐猴、猕猴、黑猩猩或人的免疫球蛋白的重链恒定区或其突变体。在一些实施方式中，所述重链恒定区包括来源于小鼠的免疫球蛋白的重链恒定区或其突变体。

18、在一些实施方式中，所述轻链恒定区包括至少一部分来源于鼠、灵长目动物、牛、马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅的免疫球蛋白的轻链恒定区或其突变体。在一些实施方式中，所述轻链恒定区包括至少一部分来源于小鼠、大鼠、狐猴、猕猴、黑猩猩或人的免疫球蛋白的轻链恒定区或其突变体。在一些实施方式中，所述轻链恒定区包括来源于小鼠的免疫球蛋白的轻链恒定区或其突变体。

19、在一些实施方式中，所述重链恒定区包括来源于iga1、iga2、igd、ige、igg1、igg2、igg3、igg4或igm免疫球蛋白的重链恒定区或其突变体。

20、在一些实施方式中，所述轻链恒定区包括来源于κ型和λ型免疫球蛋白的轻链恒定区。

21、在一些实施方式中，所述重链恒定区包括来源于igg1免疫球蛋白的重链恒定区或其突变体。

22、在一些实施方式中，所述轻链恒定区包括来源于κ型免疫球蛋白的轻链恒定区。

23、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。

24、在一些实施方式中，所述抗阿托品抗体的抗原结合片段为fab片段、fab’片段、fab’-sh片段、f(ab’)2片段、fv片段、单链fv（scfv）、dsfv或fd片段。

25、本发明第二方面提供一种分离的核酸分子，其包括编码第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

26、本领域技术人员应理解，可以根据密码子简并性对核酸分子中的核苷酸进行替换。在一些实施方式中，核酸分子的核苷酸序列是密码子最优化的。

27、在一些实施方式中，所述编码本发明第一个方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子包括：seq id no: 1，或与其具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核苷酸序列。

28、在一些实施方式中，所述编码本发明第一个方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子包括：seq id no: 3，或与其具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核苷酸序列。

29、本发明第三方面提供一种载体，其包括第二方面所述核酸分子。

30、在一些实施方式中，所述载体可以为表达载体。在一些实施方式中，所述表达载体可以包括真核表达载体和/或原核表达载体。在一些实施方式中，所述真核表达载体包括，但并不限于酵母表达载体、哺乳动物表达载体和昆虫表达载体。例如，所述表达载体可以包括，但并不限于质粒、逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关载体或单纯疱疹载体。

31、在一些实施方式中，所述载体可以选自纳米颗粒、脂质体、外来体、微泡或基因枪。

32、本发明第四方面提供一种细胞，其包括第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段、第二方面所述核酸分子或者第三方面所述载体。

33、在一些实施方式中，所述细胞不涉及繁殖材料。

34、在一些实施方式中，所述细胞可以为本领域常规使用的宿主细胞，只要能使所述表达载体稳定地将所携带的核酸分子表达为本发明的上述lmp1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以为原核细胞和/或真核细胞，所述原核细胞例如可以包括大肠杆菌，所述真核细胞例如可以包括cho细胞，hek293细胞，bhk细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，yo骨髓瘤细胞，p3x63小鼠骨髓瘤细胞，per细胞，per.c6细胞、hela细胞、vero细胞、expi293细胞、杂交瘤细胞，酵母细胞，和昆虫细胞。

35、本发明第五方面提供制备第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：第四方面所述细胞培养第四方面所述细胞，从培养的细胞培养物中收集得到所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段。

36、本发明第六方面提供一种偶联物，其包括第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段；和，偶联部分。

37、在一些实施方式中，所述偶联部分是可检测标记物。

38、在一些实施方式中，所述可检测标记物可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学、化学等手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等）、放射性核素（例如，3h、125i、35s、14c或32p）、荧光染料（例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa 750)）、吖啶酯类化合物、磁珠、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料（例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等）微珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素（例如，链霉亲和素）的生物素。在一些实施方式中，此类标记能够适用于免疫学检测（例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在一些实施方式中，所述可检测标记选自放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。在一些实施方式中，可通过不同长度的接头（linker）将如上所述可检测标记连接至本发明的抗阿托品抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

39、在一些实施方式中，所述可检测标记物可以包括，但并不限于酶（例如辣根过氧化物酶）、放射性核素、荧光染料、发光物（例如化学发光物）、有色物质、生物素等。

40、本发明第七方面提供一种免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板、结合垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上，所述结合垫负载有荧光微球-抗体偶联物，所述抗体为第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被有阿托品完全抗原。

41、在一些实施方式中，所述阿托品完全抗原由阿托品和卵清白蛋白偶联得到。

42、在一些实施方式中，所述质控线包被有羊抗鼠igg抗体。

43、本发明第八方面提供检测试剂盒，其包括：第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段、第二方面所述核酸分子、第三方面所述载体、第四方面所述细胞、第六方面所述偶联物或者第七方面所述免疫层析试纸条。

44、在一些实施方式中，所述检测试剂盒用于检测样品中的阿托品类生物碱存在或者水平。

45、在一些实施方式中，所述阿托品类生物碱包括阿托品、东莨菪碱或山莨菪碱。

46、本发明第九方面提供第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段、第二方面所述核酸分子、第三方面所述载体、第四方面所述细胞、第六方面所述偶联物、第七方面所述免疫层析试纸条或者第八方面所述检测试剂盒在（1）-（2）至少一种中的用途：

47、（1）检测样品中的阿托品类生物碱存在或者水平，该检测为非诊断目的检测；

48、（2）制备产品，所述产品用于检测样品中的阿托品类生物碱存在或者水平。

49、在一些实施方式中，所述阿托品类生物碱包括阿托品、东莨菪碱或山莨菪碱。

50、本发明第十方面提供检测样品中的阿托品类生物碱存在或者水平的方法，所述方法包括以下步骤：使所述样品与第一方面所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段接触，以允许所述抗阿托品抗体或其抗原结合片段与阿托品类生物碱形成复合物，并检测所述复合物的形成。该检测为非诊断目的检测。

51、在一些实施方式中，所述阿托品类生物碱包括阿托品、东莨菪碱或山莨菪碱。