一种体内可监测的高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系Panc02-LM4及其应用

本发明涉及生物学和肿瘤学，特别是涉及一种体内可监测的高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4及其应用。

背景技术：

1、胰腺癌是一类起病隐匿、进展迅猛、预后极差的消化系统恶性肿瘤。该病恶性程度极高，约80%患者初诊时即伴随远处转移，错失根治性手术治疗时机，患者中位生存期不足6个月，总体5年生存率仅约3%。因此，有效遏制肿瘤转移、阻断转移进程，是改善胰腺癌患者预后的核心关键。

2、在胰腺癌远处转移中，肝脏是最主要的靶向转移器官。肝脏具有血供丰富、血流速率缓慢的独特生理特征，加之特殊的细胞微环境，为胰腺肿瘤细胞的定植、增殖与生长提供了绝佳条件。一旦患者出现胰腺癌肝转移，临床治疗方案大幅受限，病情快速恶化，预后水平显著降低。目前，转移性胰腺癌的临床治疗仍面临诸多瓶颈：传统全身化疗疗效有限，且存在明显毒副作用；同时，胰腺癌肿瘤突变负荷低、免疫逃逸能力显著，导致免疫治疗临床响应效果不佳。现有基因研究虽已证实kras、tp53等基因为胰腺癌高频突变靶点，但针对上述经典靶点的靶向治疗方案，在转移性胰腺癌的临床应用中均未取得突破性疗效。究其本质，胰腺癌侵袭转移是涉及肿瘤细胞内在信号紊乱、肿瘤微环境交互调控、转移前生态位构建等多维度、多步骤的复杂生物学过程，目前其核心分子机制尚未完全阐明，临床仍缺乏靶向性强、成药潜力高的转移特异性分子靶点。

3、综上，肝转移是制约胰腺癌患者生存期的核心瓶颈，现有治疗手段疗效欠佳，根本原因在于胰腺癌肝转移的分子机制研究尚不充分，且缺乏有效的特异性干预靶点。因此，深入阐明胰腺癌肝转移的分子调控机制、挖掘可靠的治疗靶点，具有重要的临床价值与研究必要性。而构建可活体动态监测、高转移特性、分化稳定的胰腺癌肝转移细胞系，是开展肿瘤转移机制研究的重要基础，能够为解析胰腺癌肝转移进程、筛选高效治疗靶点提供可靠的实验工具。

4、目前，国内外构建胰腺癌转移细胞系的主流方法主要包括三类：一是依托kpc小鼠自发成瘤模型，构建胰腺原位肿瘤，持续饲养监测转移灶形成，最终从肝脏转移灶中分离获取胰腺癌细胞株；二是建立小鼠胰腺原位移植瘤模型，通过长期饲养观测，待转移灶形成后分离转移细胞株；三是中国专利cn118581028a公开的构建方案，通过脾脏被膜下细胞注射方式构建小鼠肝转移模型，待肝脏转移灶形成后取材获得高转移胰腺癌细胞株。

5、然而，上述传统构建技术存在诸多固有缺陷，严重制约了实验效率与模型可靠性。其一，建模周期冗长，肿瘤生长及远处转移灶形成耗时久，实验周期成本高；其二，胰腺癌肝转移成模率低，多数实验动物尚未形成明确肝脏转移灶便已死亡，建模成功率极低；其三，建模过程缺乏标准化、可视化的监测手段，仅依靠经验判断转移发生时间，无法实现活体实时追踪转移灶的发生与进展，实验重复性差；其四，缺乏精准高效的细胞筛选纯化方案，难以将肿瘤细胞与肿瘤微环境中的杂细胞完全分离，无法保证构建细胞系的纯度与稳定性。

技术实现思路

1、（一）要解决的技术问题

2、针对现有技术存在的诸多不足，本发明旨在提供一种可体内可视化监测、高肝转移、分化稳定的胰腺癌肝转移细胞系及其应用；本发明在构建所述细胞系时，以panc02细胞系为原始亲本细胞，通过自主设计并优化标准化的构建、筛选与动态监测流程，成功构建获得活体可视化、肝脏定向转移、高纯度、性状稳定的胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4。该细胞系可将整体建模及获取肝脏肿瘤细胞的周期缩短至20天以内，且小鼠胰腺癌肝转移成模率可达100%，有效解决了传统模型周期长、成模率低、无法动态监测、细胞纯度不足等技术痛点。

3、（二）技术方案

4、本发明的技术方案之一，是提供一种体内可监测的高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4，该细胞于2026年6月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no：46857；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路一号院三号中国科学院微生物研究所。

5、所述高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4的保存方法为：使用含有60%dmem完全培养基、30%胎牛血清和10% dmso的细胞冻存液冻存细胞，先将细胞放置在-80℃冰箱中进行降温，24h后将细胞转移至液氮中长期保存；

6、所述高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4的复苏方法为：

7、将细胞从液氮中取出，快速放置在37℃水浴锅中融化，离心，弃去上清，使用dmem完全培养基重悬细胞，接种、培养。

8、本发明的技术方案之二：提供一种体内可监测的高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4在药物筛选中的应用。具体为，所述panc02-lm4细胞系用于筛选具有促进或抑制胰腺癌肝转移活性的功能性组分，以及用于筛选预防、干预或治疗胰腺癌肝转移的候选药物。

9、其中，所述功能性组分包括但不限于：蛋白质、多肽、核酸、化学小分子、抗生素、中药及天然活性成分、拮抗胰腺癌肝转移相关致病菌的抗菌制剂等。

10、本发明的技术方案之三：提供一种体内可监测的高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4在模型构建中的应用。具体为，所述panc02-lm4细胞系可用于构建胰腺癌肝转移动物模型，该模型可应用于胰腺癌肝转移发生机制、侵袭进展调控机制、肿瘤微环境互作机制等相关基础研究与机制验证实验。

11、本发明的技术方案之四：提供一种胰腺癌肝转移小鼠模型的构建方法，其包括：将所述高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4注射至小鼠的脾脏，即构建获得胰腺癌肝转移小鼠模型。

12、所述胰腺癌肝转移小鼠模型包括胰腺癌肝转移模型。

13、优选地，将所述高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系panc02-lm4分散于pbs中，得到细胞浓度为2×107/50ul的细胞悬浮液，将细胞悬浮液注射到小鼠脾脏。优选地，注射量为50ul/只。注射panc02-lm4细胞系的肝转移模型小鼠肝转移发生率达到100%，且接近小鼠在3周内死亡。

14、本发明的技术方案之五：提供一种体内可监测的高侵袭性鼠源胰腺癌肝转移细胞系的构建方法，包括如下步骤：

15、s1、构建稳转亲代细胞系panc02-p：采用携带pac抗性基因与luciferase荧光报告基因的重组慢病毒为载体，感染panc02胰腺癌细胞，通过嘌呤霉素药物筛选，获得稳定表达pac基因和luciferase基因的稳转亲代细胞系panc02-p；

16、s2、首轮体内定向筛选：将所述稳转亲代细胞系panc02-p通过小鼠脾脏实质注射法构建胰腺癌肝转移模型，结合小动物光学活体成像设备监测肝转移灶形成情况；待小鼠肝脏出现稳定转移灶且荧光信号达到设定强度后，解剖分离肝转移灶，消化获取肝脏原代肿瘤细胞，经嘌呤霉素药物筛选后进行体外扩增培养，完成第1轮体内筛选富集；

17、s3、多轮迭代富集获得高转移细胞株：将s2扩增获得的肿瘤细胞，按照s2的造模、取材、筛选扩增操作方式，重复进行小鼠脾脏注射造模、肝转移灶取材、肿瘤细胞筛选扩增的迭代操作，累计完成4轮体内定向筛选；第4轮脾脏注射建模完成，待小鼠肝脏出现稳定转移灶且荧光信号达到设定强度后，解剖分离肝转移灶，消化，获取所述高定向肝转移的胰腺癌细胞株。

18、panc02小鼠胰腺癌细胞系为商品化产品（美国/atcc），经过携带pac抗性基因与luciferase荧光报告基因的重组慢病毒感染后，使panc02细胞具备了体内荧光可视化和能被嘌呤霉素药物快速筛选的特点，此时记为panc02-p。最后一轮筛选所获得的细胞命名为panc02-lm4细胞系。

19、优选地，所述pac基因为嘌呤霉素n-乙酰转移酶抗性基因，天然来源于白黑链霉菌，且人工整合重组至慢病毒载体骨架中；所述重组慢病毒为同时携带pac抗性基因和luciferase荧光报告基因的慢病毒表达载体，非空载慢病毒载体。

20、优选地，步骤s1具体包括以下操作：

21、s1-1、细胞铺板与慢病毒感染：采用含10%胎牛血清、100u/ml双抗的dmem完全培养基培养对数生长期的panc02细胞，将细胞制备为5×104个/ml的细胞悬液，取2ml细胞悬液接种于6孔板；置于37℃、5%co2培养环境中培养24h，至细胞汇合度达30%；更换新鲜dmem完全培养基，每1ml含10%胎牛血清、100u/ml双抗的dmem完全培养基中，加入5ul携带pac基因和luciferase基因的重组慢病毒及40ul助染试剂，于37℃、5%co2条件下孵育24h后，更换新鲜完全培养基；

22、s1-2、稳转细胞株筛选：向感染后的细胞体系中加入终浓度2.00μg/ml的嘌呤霉素，连续筛选6d，获得稳定表达嘌呤霉素n-乙酰转移酶和荧光素酶的panc02-p阳性稳转细胞系。

23、优选地，步骤s2和s3中每一轮体内筛选的小鼠脾脏注射操作参数完全一致，具体为：采用预冷pbs溶液重悬待注射的panc02-p细胞或筛选后肿瘤细胞，制备细胞重悬液；控制细胞重悬液浓度为2×107个/ml，每只小鼠于脾脏中部实质内定点注射50ul细胞重悬液。

24、优选地，步骤s2中肝转移灶肿瘤细胞的分离与培养筛选方法包括：

25、将解剖获取的肝脏转移灶组织进行机械剪碎，对所得小组织块进行酶消化处理，采用dmem/f12完全培养基终止消化；将消化后的细胞悬液过滤、离心后弃去上清液；采用含10%胎牛血清、100u/ml双抗的dmem完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种至t25细胞培养瓶，于37℃、5%co2条件下培养24h；弃去培养液，pbs清洗细胞2次，更换新鲜dmem完全培养基继续培养，待细胞汇合度达60%~80%时，加入含2.00μg/ml嘌呤霉素、10%胎牛血清、100u/ml双抗的dmem完全培养基持续筛选6d，筛选期间每24h采用pbs清洗细胞并更换含嘌呤霉素的新鲜培养基；筛选完成后，采用含1.00μg/ml嘌呤霉素、100u/ml双抗的dmem完全培养基进行细胞扩增培养，用于下一轮体内筛选。

26、优选地，步骤s2中模型小鼠的活体成像监测方法为：每一轮造模后的第7d、14d、21d，对模型小鼠腹腔注射300ul荧光素钾盐，静置5min后麻醉小鼠，10min后采用ivisspectrum小动物光学活体成像设备进行成像检测；有效造模标准为：仅小鼠肝脏区域检测到特异性荧光信号，其余脏器无荧光信号干扰。

27、经4轮体内定向筛选获得的高定向肝转移的胰腺癌panc02-lm4细胞系，其能够体外稳定传代、稳定表达pac基因和luciferase基因，构建的小鼠模型胰腺癌肝转移率为100%，模型小鼠均在造模3周内死亡。

28、（三）有益效果

29、本发明至少包括如下有益效果：

30、1.该细胞系具备活体动态可视化监测能力

31、本发明利用重组慢病毒载体介导基因整合，使 panc02-lm4 细胞稳定表达荧光素酶报告基因。借助 ivis spectrum 小动物光学活体成像系统，可在造模后不同时间点，无创、动态、连续监测小鼠体内肿瘤生长及肝转移灶的发生、发展全过程，无需解剖取材即可实时追踪转移进程，有效解决了传统技术仅能依靠经验判定转移时间、无法体内实时观测转移动态的弊端，显著提升实验效率与数据准确性。同时，该细胞稳定整合嘌呤霉素抗性基因，可通过嘌呤霉素持续筛选，有效杜绝杂细胞污染，保证细胞株生物学性状稳定，保障实验结果可重复。依托其可视化监测特性，还能快速区分胰腺癌肝转移细胞与瘤内其他细胞，为解析胰腺癌肝转移机制、筛选治疗药物提供便利。

32、2.该细胞系传代稳定，体内兼具高侵袭、高转移与高致死特性

33、本发明通过脾脏注射造模结合4轮体内定向迭代筛选，不断富集高肝转移潜能的肿瘤亚群，所得panc02-lm4细胞体外可长期连续传代，细胞性状均一稳定。将其接种动物后，靶向肝转移能力突出，构建的小鼠模型肝转移率可达100%，且造模小鼠3周内致死率亦为100%，克服了现有模型肝转移发生率低、动物常于转移灶形成前死亡的缺陷。相较于亲本panc02细胞，本细胞株构建的模型稳定性更强，能够高度模拟临床胰腺癌恶性增殖、靶向肝转移、病情快速进展的病理特征。

34、3.该细胞系应用范围广，科研与药物研发价值突出

35、本发明提供的细胞系可稳定构建小鼠胰腺癌肝转移模型，完整复刻胰腺癌肝转移的发生与发展过程，是研究胰腺癌肝转移分子机制、侵袭转移机理的可靠实验工具。同时，该高转移、高致死的标准化动物模型，可应用于胰腺癌肝转移靶向药物及各类治疗制剂的药效评价与药物筛选，为临床治疗新药研发、治疗方案优化提供有力的体内实验支撑，具备良好的转化应用前景。