一种细菌铁蛋白及其制药应用

本发明涉及医药，具体涉及一种细菌铁蛋白及其制药应用。

背景技术：

1、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans，a.f.)，原名铁氧化硫杆菌(thiobacillus ferrooxidans，t.f)，属于硫化细菌科(thiobacillaceae)，硫杆菌属(thiobacillus)。是一种化学营养嗜酸细菌，以氧化亚铁或还原无机硫化合物作为能量来源，自从1949年首次从矿山酸性排水中分离出来已经成为生物浸出的主要菌种之一(yanet al.,2010)。从氧化亚铁硫杆菌中分离出的铁蛋白被称为氧化亚铁硫杆菌铁蛋白(afbfr)。

2、经典铁蛋白和细菌铁蛋白通常由24个亚基自组装形成中空球形结构，其表面具有天然的通道，允许小分子进出，可通过扩散法、ph法、尿素法、温度孵育法包裹药物、核酸或显影剂等分子。凭借其天然的生物相容性、可修饰性、靶向潜力和穿越血脑屏障等优势，已成为纳米药物、示踪剂载体的最优候选之一。目前被用于医药应用的铁蛋白类型包括人铁蛋白、马脾铁蛋白、幽门螺杆菌铁蛋白、嗜热火球菌铁蛋白等，应用领域包括抗肿瘤治疗、基因治疗、分子成像、疫苗开发、炎症与退行性疾病的治疗、诊断或预防。

3、已公开的各类铁蛋白存在以下的缺陷，(1)铁蛋白载药通常采用ph法、尿素法、温度孵育法等方法，上述方法均会在一定程度上降低铁蛋白的回收率，且铁蛋白空间结构和载药策略等因素也会影响被装载的药物分子的类型；(2)除了人重链铁蛋白以外，已发现的菌铁蛋白均不具备靶向结合人转铁蛋白受体的能力，这进一步限制了其临床应用。

4、我们对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌进行了全基因组测序，发现了一系列afbfr类铁蛋白。相比于哺乳动物铁蛋白和已发现的细菌铁蛋白，我们发现afbfr类铁蛋白的一级结构较短，仅为144个氨基酸左右。afbfr类铁蛋白的三级结构存在与哺乳动物铁蛋白和细菌铁蛋白相似的四螺旋束，但是缺失了e螺旋结构，但是其具有特异性靶向结合人转铁蛋白受体的能力，能够实现药物分子的靶向递送。我们还意外地发现，afbfr类铁蛋白形成4-3-2对称性的球笼状正八面体，并包含四个大孔，且孔洞带负电荷，可以实现电势差介导的分子入腔。afbfr类铁蛋白凭借其独特的结构和功能特性，有望为解决铁蛋白载药效率和靶向递送问题提供新的思路，成为新的药物靶向递送载体。

5、参考文献：

6、yan,l.,yin,h.,zhang,s.,leng,f.,nan,w.,and li,h.(2010).biosorption ofinorganic and organic arsenic from aqueous solution by acidithiobacillusferrooxidans by-3.j hazard mater 178,209-217.

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种细菌铁蛋白，该铁蛋白属于afbfr类铁蛋白，来源于acidithiobacillaceae科，acidithiobacillus属的细菌(acidithiobacillusferrivorans、acidithiobacillus ferrooxidans、acidithiobacillus ferriphilus)或rhodocyclaceae科，rhodocyclaceae bacterium等细菌。与afbfr类铁蛋白261菌体蛋白氨基酸序列(seq id no：2)具有75％以上的同源性，具有与人转铁蛋白受体(tfr1)的结合区域，且缺少经典铁蛋白e螺旋区域。

2、所述铁蛋白氨基酸通式为a-x-b或x-b或x，所述a肽段的氨基酸序列为ma，或mawsasrsasadpa，或mpvtagwmawsasrsasadpa，mpvtagwmawsashsasadpa，所述x肽段的氨基酸如seq id no：1所示，或在对应于seq id no：1的第1-22位的位置处缺失n个氨基酸，其中n≤22，或包含在对应于seq id no：1的第3位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seqid no：1的第7位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第8位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第12位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第16位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第17位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第19位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第27位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第29位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第32位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第38位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seqid no：1的第39位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第40位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第42位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第46位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第57位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第61位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第64位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第68位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第69位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第79位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第82位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第92位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第96位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第97位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第106位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第111位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第113位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seqid no：1的第114位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第115位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第116位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第118位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第122位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第125位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第126位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第127位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第132位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第133位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第135位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第136位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第137位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第139位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第140位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第141位的位置处的氨基酸取代，或包含在对应于seq id no：1的第142位的位置处的氨基酸取代，所述b肽段的氨基酸序列为qgats，或rgats，或qgaia，或qgets，或qgatp，或qgaas，或aassgpmealvamerv。

3、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第3位的位置处的n被t取代。

4、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第7位的位置处的m被i或r取代。

5、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第8位的位置处的t被m取代。

6、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第12位的位置处的m被t取代。

7、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第16位的位置处的s被g取代。

8、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第17位的位置处的a被v或h或s取代。

9、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第19位的位置处的i被m或l取代。

10、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第27位的位置处的t被a取代。

11、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第29位的位置处的a被s取代。

12、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第32位的位置处的t被s取代。

13、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第38位的位置处的k被g或r取代。

14、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第39位的位置处的e被t或a或r取代。

15、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第40位的位置处的y被p或h取代。

16、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第42位的位置处的s被g取代。

17、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第46位的位置处的r被s取代。

18、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第57位的位置处的q被r取代。

19、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第61位的位置处的r被h取代。

20、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第64位的位置处的i被m或v或l取代。

21、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第68位的位置处的a被p取代。

22、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第69位的位置处的s被f取代。

23、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第79位的位置处的p被l取代。

24、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第82位的位置处的s被t取代。

25、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第92位的位置处的g被d或e或v取代。

26、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第96位的位置处的d被e取代。

27、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第97位的位置处的v被a取代。

28、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第106位的位置处的h被n取代。

29、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第111位的位置处的m被v取代。

30、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第113位的位置处的a被v或d取代。

31、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第114位的位置处的e被a或g取代。

32、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第115位的位置处的e被g取代。

33、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第116位的位置处的l被t取代。

34、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第118位的位置处的a被t或v取代。

35、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第122位的位置处的g被d或s取代。

36、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第125位的位置处的q被r取代。

37、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第126位的位置处的e被d取代。

38、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第127位的位置处的e被a取代。

39、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第132位的位置处的r被h取代。

40、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第133位的位置处的d被s取代。

41、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第135位的位置处的d被n取代。

42、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第136位的位置处的h被g或r取代。

43、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第137位的位置处的l被m或p取代。

44、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第139位的位置处的i被t或a取代。

45、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第140位的位置处的e被g或d取代。

46、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第141位的位置处的m被l或i取代。

47、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的第142位的位置处的h被n或r取代。

48、优选的，所述铁蛋白x肽段在对应于seq id no：1的1-6位氨基酸序列缺失或1-22位氨基酸序列缺失。

49、优选的，所述铁蛋白的氨基酸序列如seq id no：2-seq id no：35所示。

50、本发明的第二个目的是提供所述的细菌铁蛋白的制备方法，包括以下步骤：

51、s1：全基因合成his-afbfr，所述his-afbfr的核苷酸序列如seq id no：37所示；

52、s2：将s1步骤获得的重组表达载体转入大肠杆菌中进行表达，获得表达产物；

53、s3：对s2步骤获得的表达产物进行亲和层析纯化，获得afbfr蛋白，afbfr蛋白自组装为afbfr-nps。

54、本发明的第三个目的是提供一种笼状蛋白，所述笼状蛋白包含多个亚基，所述多个亚基自组装为所述笼状蛋白，其中每个所述亚基为如上述所示的菌铁蛋白。

55、优选的，所述笼状蛋白质具有特异性结合人转铁蛋白受体1(tfr1)的能力。

56、优选的，所述笼状蛋白质具有穿越血脑屏障的能力。

57、优选的，所述笼状蛋白包含药物，所述药物为化疗药物、或抗肿瘤中药、或抗神经退行性疾病的药物或抗炎药物，所述化疗药物包括烷基化剂、抗生素类药物、植物碱类药物、放射性药物；优选地，所装载的药物选自烷基化剂如顺铂、卡铂、奥沙利铂、洛铂及其衍生物；抗生素类药物如阿霉素、伊达比星、表柔比星；植物碱如长春花碱、喜树碱、鬼臼毒素；放射性药物如225ac、177lu、131i、89sr、32p、153sm；神经递质类药物如碳多奈哌齐、加兰他敏、利斯的明、酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物；多巴胺受体激动剂如左旋多巴、普拉克索、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物；神经中枢抗胆碱药如氟哌啶醇、苯扎托品及丙环定；胆碱受体激动剂类药物如毒蕈碱、毛果芸香碱、伐尼克兰；γ分泌酶抑制剂如双氟酮类；5-羟色胺系统药物如氟西汀、舍曲林、舒马普坦、丁螺环酮、昂丹司琼、米氮平；gaba能系统药物如地西泮、劳拉西泮、苯巴比妥、噻加宾、丙戊酸钠；谷氨酸能系统药物如美金刚、氯胺酮、吡仑帕奈；吡拉明、咖啡因、抗氧剂如褪黑激素；麻醉剂药物包括非阿片类麻醉药物、阿片类麻醉药物、神经安定类麻醉药。

58、本发明的第四个目的是提供一种所述的细菌铁蛋白或笼状蛋白在制备药物、诊断试剂和/或示踪试剂中的用途。

59、优选的，所述药物为治疗肿瘤、自炎性病症、血管生成病症、结核病、hiv、阿尔兹海默症、类风湿性关节炎、易损斑块薄纤维-粥样斑、多发性硬化症或肿瘤的药物；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、乳腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、皮肤癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肾上腺皮质癌、肝癌、脑癌、子宫癌、胆管癌、肉瘤、胆囊癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、横纹肌样瘤、骨癌、骨髓瘤、睾丸癌或其转移癌；所述诊断试剂为诊断肿瘤、自炎性病症、血管生成病症、结核病、hiv、阿尔兹海默症、类风湿性关节炎、易损斑块薄纤维-粥样斑、多发性硬化症或肿瘤的试剂；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、乳腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、皮肤癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肾上腺皮质癌、肝癌、脑癌、子宫癌、胆管癌、肉瘤、胆囊癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、横纹肌样瘤、骨癌、骨髓瘤、睾丸癌或其转移癌；所述示踪试剂为肿瘤示踪试剂，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、乳腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、皮肤癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肾上腺皮质癌、肝癌、脑癌、子宫癌、胆管癌、肉瘤、胆囊癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、横纹肌样瘤、骨癌、骨髓瘤、睾丸癌或其转移癌。

60、本发明的有益效果是：

61、(1)本发明提供的afbfr类铁蛋白具有的独特结构，不仅能够特异性靶向人转铁蛋白受体1，而且能够穿越血脑屏障，可用于药物的靶向递送，减少药物对正常细胞的毒性，提高药物的治疗效果。

62、(2)本发明提供的afbfr类铁蛋白能够自组装形成具有正八面体(4-3-2)对称性的纳米颗粒，并包含四个大孔，且孔洞带负电荷，可以实现电势差介导的分子入腔，可采用扩散法装载小分子或多肽类药物和探针，而不涉及对ph、盐浓度、温度等载药环境条件的改变，载药流程简单，易于操作，且不会降低药物活性，简化了传统纳米颗粒的载药步骤，降低了生产成本。

63、(3)本发明提供的afbfr类铁蛋白自组装形成纳米颗粒内腔容量大，能够实现超过100个分子/铁蛋白的载药容量。

64、(4)本发明提供的afbfr类铁蛋白自组装形成纳米颗粒在较宽范围ph条件下均能保持稳定的纳米颗粒结构，适合在复杂的生理环境中应用。

65、(5)afbfr类铁蛋白能够在大肠杆菌等原核表达载体中高效表达，并通过简单的纯化步骤获得高纯度的纳米颗粒，便于后续的药物负载和应用。

66、(6)afbfr nps不仅可以负载单一药物、诊断试剂/示踪试剂，还可以同时负载多种抗肿瘤药物或示踪试剂，具有协同治疗效果或诊断效果。