高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法及应用

本发明属于干细胞外泌体、生物材料及再生生物医药，具体涉及高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法及应用。

背景技术：

1、人脐带间充质干细胞（huc-msc）来源外泌体富含特异性膜蛋白、脂质组分、mrna及microrna等多种功能性活性物质，具有低免疫原性、抗炎、抗氧化、调控细胞增殖迁移、介导组织重塑等生物学特性，在皮肤创面修复、软组织损伤修复、炎症性疾病干预、缺血性损伤修复、药物递送载体构建等方向具有重要的科研价值与临床转化潜力。

2、现有外泌体制备技术主要包括超速离心法、聚合物沉淀法、凝胶过滤法、单一超滤法等，但各类工艺均存在固有技术短板，限制了高品质外泌体的标准化、规模化制备与临床转化应用。其中，传统单一超速离心法处理体积受限、离心耗时久，高强度剪切力易造成外泌体囊泡膜破损、内部活性成分泄漏，且游离杂蛋白、细胞碎片易发生共沉淀，导致所得产物纯度低、杂质污染严重；聚乙二醇（peg）聚合物沉淀法操作简便，但体系易残留外源聚合物组分，会显著影响外泌体天然生物活性，无法满足生物医药制剂的研发及申报要求；常规单一超滤工艺杂质筛分能力有限，难以有效区分微囊泡与外泌体组分，大粒径细胞外囊泡交叉污染率高，产物均一性差。

3、此外，传统制备流程缺乏标准化前置澄清、分级除杂体系，产物质量易受细胞培养状态、上清初始体积、离心参数波动影响，批次一致性差，难以实现稳定产业化放大生产。

4、综上，亟需一种温和、高效、低损伤、无外源残留、纯度与活性兼顾且可规模化生产的人脐带间充质干细胞外泌体制备工艺。

技术实现思路

1、针对上述现有技术存在的不足，本发明提供了高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法及应用，以解决现有技术中外泌体制备剪切损伤大、杂蛋白残留高、大粒径囊泡污染严重、批次稳定性差、难以满足生物医药转化要求的问题。

2、本发明通过构建“梯度递进澄清过滤+低温切向流过滤前置浓缩+低速离心+高速离心+密度梯度超速离心纯化”的一体化制备工艺。该工艺先经梯度过滤去除大颗粒杂质，再以低温切向流过滤前置浓缩脱除小分子游离蛋白杂质，随后结合两级梯度离心分别剔除细胞碎片与微囊泡，最后通过密度梯度超速离心纯化实现外泌体的高精度纯化。本发明全程纯物理操作，无外源聚合物添加，可有效保护外泌体膜结构完整性与生物活性，降低杂质污染，提升产物均一性与批次稳定性；同时，所得外泌体纯度高、活性好，在组织损伤修复领域具有良好的转化应用前景。

3、本发明第一方面提供了高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、收集条件培养基上清：收集人脐带间充质干细胞于无血清培养基中培养后的条件培养基上清液；

5、s2、梯度递进澄清过滤脱除细胞级大尺寸杂质：使用多级滤膜对收集的条件培养基上清液进行梯度递进澄清过滤，去除大颗粒杂质，收集滤液，获得第一上清液；

6、s3、低温切向流过滤前置浓缩去除小分子游离蛋白杂质：将第一上清液通入切向流过滤系统，采用截留分子量为100～300 kda的过滤膜包进行浓缩，排出含有小分子游离蛋白及代谢小分子的渗透液，收集截留浓缩液，获得第二上清液；

7、s4、低速离心去除细胞碎片与大颗粒聚集体：将第二上清液在3000～4000 ×g的离心力下离心20 min后收集上清，获得第三上清液；

8、s5、高速离心去除大囊泡：将第三上清液在10000 ×g的离心力下离心30 min后收集上清，获得外泌体粗提上清液；

9、s6、密度梯度超速离心纯化外泌体：将外泌体粗提上清液铺加于密度梯度介质上方，在100000～150000 ×g的离心力下离心12～20 h后收集位于不同密度梯度介质层之间界面处的外泌体富集层，获得纯化外泌体；

10、s7、洗涤去除密度梯度介质：采用无菌pbs对纯化外泌体进行重悬洗涤，去除密度梯度介质残留，获得高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体。

11、优选的，步骤s1具体为：选取第3～5代人脐带间充质干细胞，使用无血清培养基将第3～5代人脐带间充质干细胞于37℃、5%co2和饱和湿度条件下恒温培养48～72h后，收集人脐带间充质干细胞于无血清培养基中培养后的条件培养基上清液，其中，第3～5代人脐带间充质干细胞是通过采用无血清培养基培养初代人脐带间充质干细胞并进行传代扩增后获得；

12、步骤s2中多级滤膜是孔径依次为4 μm、1.2 μm和0.45 μm的三级滤膜，并按照孔径由大到小的顺序进行过滤；

13、步骤s3中过滤膜包为改性聚醚砜膜包，整个切向流过滤过程在密闭无菌条件下进行；切向流过滤处理中，跨膜压力为0.2～0.6 bar，切向流速为80～120 ml/min，浓缩倍数为5～10倍。

14、优选的，无血清培养基由基础培养基与人间充质干细胞培养添加物按19:1的体积比混合配置而成。

15、优选的，密度梯度介质为蔗糖或碘克沙醇，优选蔗糖；

16、步骤s6具体为：

17、s61、配制20%和40%的蔗糖缓冲液，于超速离心管中自下而上依次铺设40%蔗糖层、20%蔗糖层，形成20%/40%双层蔗糖垫；

18、s62、将外泌体粗提上清液铺加于20%蔗糖层之上，在100000～150000×g的离心力下离心12～20 h，离心结束后，于20%与40%蔗糖层之间的两相界面处收集外泌体富集层，获得纯化外泌体。

19、优选的，步骤s6中超速离心结束后，采用无刹车自由滑行方式停机。

20、优选的，步骤s7中将步骤s6收集的纯化外泌体转移至超速离心管中，采用无菌pbs对纯化外泌体重悬洗涤2次，获得高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体，其中，每次重悬洗涤操作具体为：向超速离心管中加入无菌pbs缓冲液，在110000×g的离心力下离心70～90min，弃去含密度梯度介质的上清液，保留外泌体沉淀。

21、优选的，制备外泌体时，步骤s2～s7中的过滤、离心、浓缩及洗涤操作均于4℃低温条件下进行；

22、外泌体制备过程中采用纯物理分离工艺，不添加外源化学助剂。

23、优选的，外源化学助剂为peg聚合物沉淀剂。

24、本发明第二方面提供了前述高纯度高活性人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法制得的外泌体在制备生物制剂中的应用，所述生物制剂用于促进组织损伤修复。

25、优选的，组织损伤修复包括皮肤创面修复、软组织损伤修复和缺血性组织损伤修复。

26、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

27、1、本发明通过构建“梯度递进澄清过滤+低温切向流过滤前置浓缩+低速离心+高速离心+密度梯度超速离心纯化”的一体化制备工艺，解决了现有技术中外泌体制备剪切损伤大、杂蛋白残留高、大粒径囊泡污染严重、批次稳定性差、难以满足生物医药转化要求的问题，还有效保护了外泌体膜结构完整性与生物活性，降低了杂质污染，提升了产物均一性与批次稳定性。

28、2、本发明突破了传统“先离心、后纯化”的制备流程，采用梯度递进澄清过滤与低温切向流过滤前置浓缩的工艺架构，在超速离心前即完成上清中小分子游离杂蛋白与代谢小分子杂质的预去除，大分子蛋白聚集体则通过密度梯度超速离心进一步分离，达到了从源头降低杂质负荷的目的，显著提升了外泌体纯度及颗粒蛋白比，有效克服了传统工艺中目标产物与杂质共沉淀、纯化不彻底的固有缺陷。

29、3、本发明采用切向流过滤的温和流体分离原理，替代传统高强度离心剪切分离方式，配合全程4℃低温操作环境，显著降低了外泌体囊泡破损与活性成分泄漏的风险，有效保护了外泌体的完整膜结构与生物学功能，所得产物生物活性优于传统工艺。

30、4、本发明通过梯度过滤、两级离心与密度梯度超速离心纯化构成的多级纯化体系，逐级精准剔除细胞碎片、大颗粒聚集体及大粒径微囊泡，终产物中外泌体样囊泡的粒径主要分布于30～200 nm，粒径分布均一、杂质含量极低。

31、5、本发明全程采用物理过滤、浓缩及离心分离手段，不添加peg沉淀剂、絮凝剂、染色剂等任何外源化学试剂，无化学残留风险，制备过程安全可控，符合生物医药制剂的研发与申报要求。

32、6、本发明中切向流过滤浓缩参数精准可控，制备流程标准化程度高，工艺稳定性不受初始上清体积及批次间细胞状态小幅波动的影响，批次重复性好，既可满足实验室小批量制备需求，亦可适配工业化大规模生产，具有良好的产业化转化前景。

33、7、本发明虽然在最终纯化步骤中采用了12～20h的密度梯度超速离心，但在此之前已通过梯度递进澄清过滤、低温切向流过滤前置浓缩及两级离心完成了样品的减容与预纯化，待密度梯度超速离心处理的样品体积已大幅缩小，绝大部分细胞碎片、大颗粒杂质及大粒径微囊泡已在前端步骤被有效去除。因此，本发明省去了传统工艺中多轮大体积差速超速离心沉淀-重悬的繁琐操作，有效减少了样本转移次数，降低了外泌体在管壁的非特异性吸附损失，显著缩短了整体操作工时；同时，由于进入密度梯度离心步骤的样本中杂质负荷已大幅降低，梯度分离的精准度得以提升，有效避免了传统工艺中杂质共分离对终产物纯度的干扰。

34、8、人脐带间充质干细胞来源外泌体通常富含多种功能性细胞因子、调控rna及结构蛋白，具备促进细胞增殖迁移、减少细胞凋亡、介导血管新生与组织重塑的生物学作用。本发明所得高纯度高活性外泌体完整保留了上述生物学潜能，在皮肤创面愈合、软组织损伤修复、缺血性组织损伤修复等再生医学领域应用前景广阔。