一种化学成分限定的间充质干细胞培养基及其三维细胞培养应用的制作方法

本发明属于细胞培养，具体涉及一种间充质干细胞化学成分限定培养基及其制备方法、应用。

背景技术：

1、间充质干细胞是一种多能分化干细胞，几乎生活在所有间充质来源的组织中，包括脐带、骨髓、脂肪、骨膜、牙龈结缔组织、牙髓和牙周膜等。间充质干细胞可以分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞，并具有广泛的增殖、自我更新能力、旁分泌作用以及免疫调节特性，可促进受损组织的所有再生阶段，因此成为细胞治疗和再生医学的重要来源。脐带来源的间充质干细胞具有数量多、增殖能力强、纯度高和基因突变风险小的优点，成为目前最具有临床应用价值和保存价值的干细胞。

2、截至2023年11月，已经有1600项使用骨髓间充质干细胞治疗疾病的临床试验登记在册。由于msc数量有限，为了获得足够数量的细胞用于预期的治疗应用，间充质干细胞需要经过体外培养扩增，微环境在干细胞命运决定中起着关键作用。传统的二维培养无法为间充质干细胞维持合适的微环境，增殖效率和空间利用率低，延长培养时间会导致间充质干细胞丧失多能性并诱导细胞衰老；三维培养在体外使间充质干细胞依附于基质成分聚集成球体，模拟天然组织微环境的结构和功能特征，可以更好地维持细胞增殖、存活以及干细胞特性，因此开发适宜的三维培养扩增策略已成为当前的技术和经济挑战。

3、化学成分限定培养基主要由基础培养基和添加因子组成。基础培养基包含了维持细胞生长代谢所必需的葡萄糖、氨基酸、维生素和无机盐等，添加因子包括激素、生长因子、结合蛋白、粘附因子、微量元素、氨基酸、核苷酸、脂类、维生素、糖类、多胺类、有机酸、还原剂和缓冲系统等。目前的商用化学成分限定培养基尚未完全解决间充质干细胞在三维培养过程中的贴附、迁移、稳定增殖等问题，无法满足间充质干细胞生物研究和临床应用需要，广泛应用于间充质干细胞三维大规模扩增的仍是含有血清替代成分的无血清培养基，培养基颗粒数含量较高。

4、聚乙烯醇是一种分子链中含有大量羟基基团的高分子水溶性聚合物，具有强的水溶性及亲水性，分子式为[-ch2ch(oh)-]n，其中n是包含在100至10000之间的整数。聚乙烯醇根据水解度分为82％、86％、88％、90％、97％、98％、99％、100％等，其中大于98％者称为完全水解型，其余为部分水解型。聚乙烯醇是一种血清替代物，可以维持细胞稳定状态，促进细胞增殖，经常作为基础培养基的大分子组分。泊洛沙姆188是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(peo-ppo-peo)三嵌段共聚物，亲水亲脂平衡(hlb)值约为29，0.1％水溶液可降低表面张力至50dyn/cm左右(室温)。其用于细胞培养基中，可保护细胞免受水动力影响，降低流体剪切力损伤；也可用于减少悬浮搅拌培养过程中的泡沫形成，并降低细胞对反应器罐壁的黏附。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供新型的间充质干细胞化学成分限定培养基，该培养基化学成分明确，无蛋白水解成分和血清替代因子等，促进间充质干细胞在三维载体上稳定增值，每代增殖倍数为7-10倍，培养基颗粒浓度低于10e+08，上清可用于外泌体收获，外泌体分泌量为3.34e+12/l完全培养基。

2、第一方面，本发明提供了一种间充质干细胞限定成分培养基，由基础培养基和添加成分组成。所述基础培养基选自imdm、α-mem、高糖dmem、dmem/f12、1640中的一种或多种，优选imdm；imdm提供了细胞生长基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、核酸衍生物等。所述添加成分选自结合蛋白类物质、粘附因子类物质、激素类物质、维生素类物质、有机酸类物质、氨基酸类物质、糖类物质、生长因子类物质、含微量元素物质、核苷类物质、生物胺类物质、阿司匹林、泊洛沙姆188、聚乙烯醇、大豆胰酶抑制剂中的一种或多种，添加成分为细胞提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。

3、其中，结合蛋白可以促进细胞的生长，同时也是一些有害微量元素的螯合剂。结合蛋白类物质选自转铁蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种。人血清白蛋白是一种重要的营养物质，其分解产生的氨基酸、能量或其他含氮物质为细胞生长代谢提供物质基础。此外，人血清白蛋白可以为细胞提供合适的ph和渗透压，维持细胞生长的渗透压平衡，避免细胞遭受ph波动和机械力损伤，还与培养基中激素、生长因子、维生素、脂类和金属离子可逆结合，作为载体发挥稳定和调节的上述活性物质的作用。转铁蛋白能够结合并转运铁离子，为细胞代谢提供所需的铁元素。同时，转铁蛋白还具有抗菌活性，维持细胞增殖和分化等。

4、其中，粘附因子可以促进细胞的黏连生长，显著提高细胞的贴壁率，维持细胞形态结构，增强细胞代谢，促进遗传物质合成，提高原代细胞培养的成活率，大大缩短细胞生长时间。粘附因子类物质选自纤粘蛋白。

5、其中，激素在细胞生长、代谢、信号传导等方面十分重要，如胰岛素在哺乳动物细胞的合成和代谢方面起重要作用，可以促进细胞增殖。激素类物质选自胰岛素、甲状旁腺激素、雌二醇、孕酮、氢化可的松、地塞米松中的一种或多种。胰岛素能够调节葡萄糖和脂质代谢、基因表达、蛋白质合成以及细胞生长、分裂和存活等关键生物过程。甲状旁腺激素可以调节细胞外液中钙离子浓度。类固醇激素可自由进入细胞，激活细胞内的核受体，调控基因转录，从而影响心血管系统和骨骼肌肉系统等发育。地塞米松、氢化可的松参与间充质干细胞的糖类、脂类等成分的代谢，并参与干细胞免疫抑制。

6、其中，维生素作细胞培养基的生长补充剂，具有抗氧化和抗老化的效果，消除过氧化物和致病自由基以保护细胞，用于增加间充质干细胞的生长和活力。维生素类物质选自括维生素a和维生素c中的一种或多种。

7、其中，所述有机酸类物质选自牛磺酸、丙酮酸中的一种或多种；牛磺酸具有抗氧化作用、稳定细胞膜作用、保持细胞ca2+稳定的作用，积极发挥细胞保护效应。化学成分确定的培养基中加入牛磺酸还可以增加感兴趣蛋白的产量。丙酮酸是一种酸性较弱的有机酸，将其添加到培养基中为合成代谢过程提供能量来源和碳的骨架。丙酮酸的加入有助于在血清浓度降低时维持细胞状态，有助于克隆增殖；丙酮酸还是过氧化物清除剂，具有防止自由基损伤的作用。

8、其中，所述氨基酸类物质选自非必须氨基酸，非必需氨基酸(nonessential aminoacids)包括了丙氨酸(l-alanine)、天冬氨酸(l-aspartic acid)、天冬酰胺(l-asparagine)、谷氨酸(l-glutamic acid)、脯氨酸(l-proline)、丝氨酸(l-serine)、甘氨酸(glycine)。在细胞培养基中添加适当浓度的非必需氨基酸能减轻细胞在合成方面的负担，提高其他营养成分的利用率。

9、其中，所述糖类物质选自果糖，果糖是一种葡萄糖结构异构体，因为它的摄取和利用受到更严格的控制，可以成为替代碳源，以供细胞新陈代谢。

10、其中，生长因子通常能和靶细胞膜上特异性受体结合，进而影响细胞有丝分裂、蛋白质合成及分化，是维持细胞体外生长增殖、分裂分化所必需的生物补充因子，如转化生长因子能够维持干细胞的自我更新能力及分化潜能。生长因子类物质选自血小板衍生因子pdgf-bb、表皮生长因子egf、转化生长因子tgf-β1和tgf-β3、成纤维细胞生长因子b-fgf、类胰岛素生长因子igf i、血管内皮生长因子vegf、结缔组织生长因子ctgf、肝细胞生长因子hgf、白血病抑制因子lif、白细胞介素类生长因子il 2等、促红细胞生成素epo、干细胞生长因子scf、肿瘤坏死因子tnf-α中的一种或多种，多种生长因子协同作用刺激间充质干细胞增殖和分化。

11、其中，微量元素如硒是其中最常见的，硒是一种生命必需的微量元素，参与抗氧化酶(如谷胱甘肽过氧化物酶-gpx、硫氧还原酶-trxr以及三种脱碘酶-d1、d2、d3)的作用过程，具有强大的抗氧化活性，抵御过氧化物和超氧化物对细胞的损伤。含微量元素物质选自亚硒酸钠。

12、其中，核苷是构成dna的物质基础，参与细胞遗传物质和蛋白质合成，提供能量以维持细胞代谢等。核苷类化合物选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷中的一种或多种。

13、其中，生物胺在刺激细胞生长中起重要作用，可以延长细胞的周期，发挥抗凋亡作用，提高细胞的增殖密度。生物胺类物质选自乙醇胺、腐胺中的一种或多种，胺可以合成精胺，稳定dna分子；乙醇胺能够促进细胞膜的构建。

14、其中，阿司匹林具有抗衰老的作用，被广泛用于改善健康和延长寿命，可以提高细胞增殖活力。

15、其中，大豆胰酶抑制剂，是抗蛋白酶成分，起到中和作用，终止传代过程中胰蛋白酶的消化作用。

16、其中，聚乙烯醇是完全水解型，粘度为11-14cp；聚乙烯醇是一种血清替代物，可以维持细胞稳定状态，促进细胞增殖；泊洛沙姆188是一种有效的剪切力保护剂，对细胞有稳定作用。

17、优选的，本发明间充质干细胞化学成分限定培养基中的添加剂的成分和含量可以是：重组人血清白蛋白0.5～50g/l、重组人转铁蛋白0.1～10mg/l、重组人纤连蛋白fn 0～100mg/l、胰岛素1～100mg/l、孕酮0～50μg/l、雌二醇0～50μg/l、地塞米松1～150μg/l、氢化可的松0.05～5mg/l、甲状旁腺激素0～10μg/l、维生素a 0-1000μm、维生素c 25～2000mg/l、非必须氨基酸neaa 0-500mg/l、牛磺酸0～50mg/l、丙酮酸0-500mg/l、腐胺0～100mg/l、氨基乙醇0.5～50mg/l、亚硒酸钠2.0～100μg/l、大豆胰酶抑制剂0～100mg/l、表皮生长因子(egf)1～500μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)1～500μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)1～500μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)1～500μg/l、血管内皮生长因子(vegf)0～500μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)1～500μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)0～500μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)0～500μg/l、干细胞因子(scf)0～500μg/l、肝细胞生长因子(hgf)0～500μg/l、白细胞介素-2(il-2)0～500μg/l、白血病抑制因子(lif)0～500μg/l、促红细胞生成素(epo)0～100μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)0～100μg/l、脱氧腺苷0～500mg/l、脱氧胞苷0～500mg/l、脱氧鸟苷0～500mg/l、果糖0～500mg/l、阿司匹林0-100μm、泊洛沙姆1880-1000mg/l、聚乙烯醇0-100mg/ml。更优选的，添加剂的成分和含量为：重组人血清白蛋白1.25g/l、重组人转铁蛋白5.5mg/l、胰岛素10mg/l、地塞米松100μg/l、氢化可的松0.36mg/l、维生素c 100mg/l、氨基乙醇2mg/l、亚硒酸钠10μg/l、表皮生长因子(egf)20μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)20μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)20μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)20μg/l。

18、优选的，本发明间充质干细胞化学成分限定培养基中的添加剂的成分和含量还可以是：重组人血清白蛋白0.5～50g/l、重组人转铁蛋白0.1～10mg/l、重组人纤连蛋白fn 1～100mg/l、胰岛素1～100mg/l、孕酮0.5～50μg/l、雌二醇0.5～50μg/l、地塞米松1～150μg/l、氢化可的松0.05～5mg/l、甲状旁腺激素0.1～10μg/l、维生素a10-1000μm、维生素c 25～2000mg/l、非必须氨基酸neaa 1-500mg/l、牛磺酸0.5～50mg/l、丙酮酸1-500mg/l、腐胺2～100mg/l、氨基乙醇0.5～50mg/l、亚硒酸钠2.0～100μg/l、大豆胰酶抑制剂1～100mg/l、表皮生长因子(egf)1～500μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)1～500μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)1～500μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)1～500μg/l、血管内皮生长因子(vegf)1～500μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)1～500μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)1～500μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)1～500μg/l、干细胞因子(scf)1～500μg/l、肝细胞生长因子(hgf)1～500μg/l、白细胞介素-2(il-2)1～500μg/l、白血病抑制因子(lif)1～500μg/l、促红细胞生成素(epo)0.1～100μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)0.1～100μg/l、脱氧腺苷1～500mg/l、脱氧胞苷1～500mg/l、脱氧鸟苷1～500mg/l、果糖1～500mg/l、阿司匹林1-100μm、泊洛沙姆1880-1000mg/l、聚乙烯醇0-100mg/ml。更优选的，添加剂的成分和含量为：重组人血清白蛋白1.25g/l、重组人转铁蛋白5.5mg/l、重组人纤连蛋白fn 2mg/l、胰岛素10mg/l、孕酮2.7μg/l、雌二醇1.3μg/l、地塞米松100μg/l、氢化可的松0.36mg/l、甲状旁腺激素35.74μg/l、维生素a 50μm、维生素c 100mg/l、非必须氨基酸neaa 10mg/l、牛磺酸1.25mg/l、丙酮酸50mg/l、腐胺5.3mg/l、氨基乙醇2mg/l、亚硒酸钠10μg/l、大豆胰酶抑制剂1mg/l、表皮生长因子(egf)20μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)20μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)20μg/l、血管内皮生长因子(vegf)20μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)20μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)20μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)20μg/l、干细胞因子(scf)20μg/l、肝细胞生长因子(hgf)20μg/l、白细胞介素-2(il-2)10μg/l、白血病抑制因子(lif)20μg/l、促红细胞生成素(epo)10μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)10μg/l、脱氧腺苷10mg/l、脱氧胞苷11mg/l、脱氧鸟苷10mg/l、果糖20mg/l、阿司匹林10μm。

19、优选的，本发明间充质干细胞化学成分限定培养基中的添加剂的成分和含量也可以是：重组人血清白蛋白0.5～50g/l、重组人转铁蛋白0.1～10mg/l、重组人纤连蛋白fn 1～100mg/l、胰岛素1～100mg/l、孕酮0.5～50μg/l、雌二醇0.5～50μg/l、地塞米松1～150μg/l、氢化可的松0.05～5mg/l、甲状旁腺激素0.1～10μg/l、维生素a10-1000μm、维生素c 25～2000mg/l、非必须氨基酸neaa 1-500mg/l、牛磺酸0.5～50mg/l、丙酮酸1-500mg/l、腐胺2～100mg/l、氨基乙醇0.5～50mg/l、亚硒酸钠2.0～100μg/l、大豆胰酶抑制剂1～100mg/l、表皮生长因子(egf)1～500μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)1～500μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)1～500μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)1～500μg/l、血管内皮生长因子(vegf)1～500μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)1～500μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)1～500μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)1～500μg/l、干细胞因子(scf)1～500μg/l、肝细胞生长因子(hgf)1～500μg/l、白细胞介素-2(il-2)1～500μg/l、白血病抑制因子(lif)1～500μg/l、促红细胞生成素(epo)0.1～100μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)0.1～100μg/l、脱氧腺苷1～500mg/l、脱氧胞苷1～500mg/l、脱氧鸟苷1～500mg/l、果糖1～500mg/l、阿司匹林1-100μm、泊洛沙姆18810-1000mg/l、聚乙烯醇1-100mg/ml。更优选的，添加剂的成分和含量为：重组人血清白蛋白1.25g/l、重组人转铁蛋白5.5mg/l、重组人纤连蛋白fn 2mg/l、胰岛素10mg/l、孕酮2.7μg/l、雌二醇1.3μg/l、地塞米松100μg/l、氢化可的松0.36mg/l、甲状旁腺激素35.74μg/l、维生素a 50μm、维生素c 100mg/l、非必须氨基酸neaa 10mg/l、牛磺酸1.25mg/l、丙酮酸50mg/l、腐胺5.3mg/l、氨基乙醇2mg/l、亚硒酸钠10μg/l、大豆胰酶抑制剂1mg/l、表皮生长因子(egf)20μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)20μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)20μg/l、血管内皮生长因子(vegf)20μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)20μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)20μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)20μg/l、干细胞因子(scf)20μg/l、肝细胞生长因子(hgf)20μg/l、白细胞介素-2(il-2)10μg/l、白血病抑制因子(lif)20μg/l、促红细胞生成素(epo)10μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)10μg/l、脱氧腺苷10mg/l、脱氧胞苷11mg/l、脱氧鸟苷10mg/l、果糖20mg/l、阿司匹林10μm、泊洛沙姆188100mg/l、聚乙烯醇10mg/ml。第二方面，本发明还提供了间充质干细胞化学成分限定培养基的制备方法，如下：本发明提供了一种间充质干细胞限定成分培养基的制备方法：将除了基础培养基外的其他组分按比例混合，制得添加组剂b，制得的添加组剂b加入到基础培养基组剂中，制得间充质干细胞化学成分限定培养基。

20、第三方面，本发明还提供了间充质干细胞化学成分限定培养基用于三维实验培养的应用。其三维培养实验步骤如下：(1)设备及培养瓶准备：安装调试设备和培养瓶或三维培养六孔板，保持无菌状态，备用。(2)微载片及细胞准备：取100毫克华龛市售w01微载片投入125毫升培养瓶中，加入20ml限定成分培养基，晃动培养瓶使微载片均匀分散；准备适量细胞悬液(250万mscs/ml)备用。(3)细胞接种及培养：按照常规二维方法培养人脐带间充质干细胞，消化后将1ml细胞悬液(250万msc)加入培养瓶中，补加培养基至50ml；或者将200μl细胞悬液(50万msc)加入三维培养六孔板中，补加培养基至8ml，设置反应器参数：40rpm5min，0rpm 25min，至少24次循环后，40rpm恒速，置于培养箱中培养。1天后培养瓶补充25ml限定成分培养基继续培养3天，三维培养六孔板培养四天收获。(4)细胞取样观察：使用无菌移液管吸取少量微载体悬液置于96孔板中(推荐每孔25-50μl样品)，通过荧光标记染色的方法进行细胞观察。(5)细胞收获：停止搅拌生物反应器，待微载体沉降后弃上清，加入裂解液裂解消化，待微载体全部降解，收集细胞悬液，离心，弃上清，pbs重悬细胞，再离心，弃上清。根据需求，将细胞重悬至适合密度，备用。(6)细胞计数：取少量(推荐50-100μl)裂解后重悬一次的细胞悬液，置于细胞计数仪或计数板进行计数，最后检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。

21、本发明的有益效果

22、(1)本发明所述培养基化学成分明确，无蛋白水解成分和血清替代因子等，避免血清或血替成分带来的不稳定性、病源污染等风险，解决间充质干细胞临床应用的安全性问题。

23、(2)本发明的培养基颗粒数低于10e+08，对于外泌体收获干扰低，可用于收获外泌体的msc扩增实验。