一种用于人间充质干细胞分泌组的无血清诱导培养基及其应用的制作方法

本发明属于细胞培养基，具体涉及一种用于人间充质干细胞分泌组的无血清诱导培养基及其应用。

背景技术：

1、人间充质干细胞是一类具有自我更新能力、多向分化潜能及强大旁分泌功能的成体干细胞，其分泌组包含细胞外囊泡、生长因子、细胞因子、趋化因子等多种活性产物，在组织修复、抗炎免疫调节、抗氧化、抗衰老等领域具备极高的科研价值与临床应用前景。相较于干细胞直接移植治疗，干细胞分泌组产物具有安全性高、无免疫排斥、易储存运输、可批量规模化制备等优势，现已成为细胞治疗、再生医学、医美生物制剂等领域的核心研究与产业化方向。而培养基作为人间充质干细胞体外扩增、活性调控及分泌产物合成的核心载体，其配方组成与设计思路直接决定了干细胞的增殖状态、表型稳定性及分泌组产物的产量与活性，是制约干细胞分泌组工业化制备与临床转化的关键核心条件。

2、目前，国内外针对人间充质干细胞体外培养的培养基体系主要分为含血清培养基、商业化通用无血清培养基、功能改良型培养基三大类，可基本满足干细胞体外存活与基础增殖需求。其中，含血清培养基以dmem/f12、α-mem为基础培养基，添加10%-20%胎牛血清，是传统的干细胞培养方案，具备细胞增殖速度快的优势，但胎牛血清存在批次差异大、异源性病原污染风险高、成分复杂不明等问题，极易干扰后续分泌组产物的分离纯化，且不符合临床级生物制剂的生产标准，无法应用于高端产业化及临床场景。

3、为解决含血清培养基的缺点，行业逐步推广商业化无血清培养基，该类培养基去除了动物血清，通过添加生长因子替代血清功能，可有效维持人间充质干细胞的体外生长、抑制细胞凋亡、稳定细胞干性表型，规避了异源性污染风险与批次差异问题。但该类培养基的核心设计目标仅聚焦于促进干细胞快速增殖、维持细胞基础干性，完全未针对干细胞分泌组合成、囊泡生成、活性产物释放的生理过程进行配方优化，导致干细胞在该类培养基中培养时，旁分泌活性弱、细胞外囊泡及活性因子产量低，单位细胞的分泌效率极差，无法满足干细胞分泌组规模化、高产量的制备需求。

4、现有技术中也存在少量针对干细胞功能改良的培养基方案，主要通过在基础无血清培养基中添加单一功能性因子调控细胞功能。但此类改良方案的优化方向均集中于干细胞定向分化诱导，并未关注干细胞的分泌功能调控，无法提升分泌组产物的合成与释放能力，依然无法适配分泌组制备的核心需求。

5、综上，当前行业内尚且缺乏一种以提升干细胞分泌组产量为核心目标，可同时兼顾细胞增殖、干性维持与高效分泌功能的无血清培养基，导致人间充质干细胞分泌组产物制备效率低、成本高、产能不足，极大限制了干细胞分泌组相关产品的临床转化与工业化大规模生产。

技术实现思路

1、基于上述技术背景，本发明的主要目的在于提供一种用于人间充质干细胞分泌组的无血清诱导培养基及其应用，以克服现有技术中培养基无法同时兼顾细胞增殖、干性维持与高效分泌功能，导致人间充质干细胞分泌组产物制备效率低、成本高、产能不足的问题。

2、为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

3、本发明第一方面在于提供一种用于人间充质干细胞分泌组的无血清诱导培养基，所述用于人间充质干细胞分泌组的无血清诱导培养基包括基础培养基、分泌诱导因子组合物、膜合成与囊泡生成组合物、代谢与氧化还原调节组合物。

4、所述基础培养基包括重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、亚硒酸钠、重组人白蛋白、谷氨酰胺或glutamax™、非必须氨基酸、抗坏血酸-2-磷酸。

5、基础细胞培养基中，重组人胰岛素用于促进葡萄糖摄取和代谢。重组人转铁蛋白作为铁离子载体，可维持氧化还原平衡。亚硒酸钠具有抗氧化、协同转铁蛋白的功能。重组人白蛋白作为载体蛋白，可维持渗透压。谷氨酰胺或glutamax™作为能量代谢底物。非必需氨基酸用于补充合成代谢所需的氨基酸。抗坏血酸-2-磷酸为稳定型维生素c，具有抗氧化和胶原合成的作用。

6、所述分泌诱导因子组合物包括促囊泡生成组分、促进膜合成组分、增强蛋白合成组分、促进囊泡释放组分、调节基因表达组分。

7、所述促囊泡生成组分优选为重组人bfgf。

8、所述促进膜合成组分选自重组人egf、kgf或hgf中的一种或几种。

9、优选地，所述促进膜合成组分为重组人egf。

10、所述增强蛋白合成组分选自重组人igf-1、pdgf-bb或vegf中的一种或几种。

11、优选地，所述增强蛋白合成组分为重组人igf-1。

12、所述促进囊泡释放组分选自氢化可的松或低浓度tgf-β1中的一种或两种。

13、优选地，所述促进囊泡释放组分为氢化可的松。

14、所述调节基因表达组分选自全反式维甲酸、bmp-2或bmp-4中的一种或几种。

15、优选地，所述调节基因表达组分为全反式维甲酸。

16、根据本发明一种优选地实施方式，所述分泌诱导因子组合物包括重组人bfgf、重组人egf、重组人igf-1、氢化可的松、全反式维甲酸。

17、在分泌诱导因子组合物中，重组人bfgf用于激活mapk/erk通路，促进囊泡生成。重组人egf用于促进膜合成和囊泡运输。重组人igf-1用于增强蛋白合成和细胞代谢活性。氢化可的松用于调节膜流动性，促进囊泡释放。全反式维甲酸用于调节基因表达，促进分泌表型。

18、所述膜合成与囊泡生成组合物包括膜合成组分、膜磷脂合成组分、脂肪酸提供组分。

19、所述膜合成组分选自胆固醇-环糊精复合物、外源性囊泡碎片中的一种或两种。

20、所述外源性囊泡碎片作为膜原料供应的替代来源，通过“膜回收”途径可促进囊泡生成。

21、优选地，所述膜合成组分为胆固醇-环糊精复合物。

22、所述膜磷脂合成组分选自磷脂酰胆碱、鞘磷脂、脂质体混合物中的一种或几种。

23、优选地，所述膜磷脂合成组分为磷脂酰胆碱、鞘磷脂。

24、所述脂肪酸提供组分选自中链脂肪酸、亚油酸-白蛋白复合物中的一种或几种。

25、优选地，所述脂肪酸提供组分为亚油酸-白蛋白复合物。

26、根据本发明一种优选地实施方式，所述膜合成与囊泡生成组合物包括胆固醇-环糊精复合物、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、亚油酸-白蛋白复合物。

27、在膜合成与囊泡生成组合物中，胆固醇-环糊精复合物用于提供膜合成原料，促进囊泡出芽。磷脂酰胆碱作为膜磷脂合成底物。鞘磷脂参与脂筏结构形成，促进囊泡生成。亚油酸-白蛋白复合物提供必须脂肪酸。

28、所述代谢与氧化还原调节组合物包括谷胱甘肽前体组分、还原性组分、能量代谢底物组分。

29、所述谷胱甘肽前体组分选自n-乙酰半胱氨酸、α-硫辛酸、辅酶q10或还原型谷胱甘肽中的一种或两种。

30、优选地，所述谷胱甘肽前体组分为n-乙酰半胱氨酸。

31、所述还原性组分优选为β-巯基乙醇。

32、所述能量代谢底物组分选自丙酮酸钠、乳酸钠中的一种或两种。

33、优选地，所述能量代谢底物组分为丙酮酸钠。

34、根据本发明一种优选地实施方式，所述代谢与氧化还原调节组合物包括n-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙醇、丙酮酸钠。

35、在代谢与氧化还原调节组合物中，n-乙酰半胱氨酸作为谷胱甘肽的前体，可降低氧化应激。β-巯基乙醇可维持还原性环境，保护分泌产物的活性。丙酮酸钠补充能量代谢底物。

36、优选地，所述基础培养基中，重组人胰岛素的浓度为5～20μg/ml，重组人转铁蛋白的浓度为5～15μg/ml，亚硒酸钠的浓度为5～20ng/ml，重组人白蛋白的浓度为1～5mg/ml，谷氨酰胺或glutamax™的浓度为2～6mm，非必需氨基酸的浓度为1×，抗坏血酸-2-磷酸的浓度为50～200μg/ml。

37、更优选地，所述基础培养基中，重组人胰岛素的浓度为15μg/ml，重组人转铁蛋白的浓度为10μg/ml，亚硒酸钠的浓度为15ng/ml，重组人白蛋白的浓度为3mg/ml，谷氨酰胺或glutamax™的浓度为4mm，非必需氨基酸的浓度为1×，抗坏血酸-2-磷酸的浓度为150μg/ml。

38、优选地，所述分泌诱导因子组合物中，促囊泡生成组分的浓度为5～50ng/ml，促进膜合成组分的浓度为5～30ng/ml，增强蛋白合成组分的浓度为10～100ng/ml，促进囊泡释放组分的浓度为50～500nm，调节基因表达组分的浓度为0.1～2μm。

39、更优选地，所述分泌诱导因子组合物中，促囊泡生成组分的浓度为30ng/ml，促进膜合成组分的浓度为20ng/ml，增强蛋白合成组分的浓度为50ng/ml，促进囊泡释放组分的浓度为250nm，调节基因表达组分的浓度为1μm。

40、优选地，所述膜合成与囊泡生成组合物中，膜合成组分的浓度为1～10μg/ml，膜磷脂合成组分为6～25μg/ml，其中，磷脂酰胆碱和鞘磷脂的浓度比为（5～20）：（1～5），脂肪酸提供组分的浓度为5～15μg/ml。

41、更优选地，所述膜合成与囊泡生成组合物中，胆固醇-环糊精复合物的浓度为5μg/ml，膜磷脂合成组分为6～25μg/ml，其中，磷脂酰胆碱和鞘磷脂的浓度比为15：3，脂肪酸提供组分的浓度为10μg/ml。

42、优选地，所述代谢与氧化还原调节组合物中，谷胱甘肽前体组分的浓度为0.5～2mm，还原性组分的浓度为50～100μm，能量代谢底物组分的浓度为1～5mm。

43、更优选地，所述代谢与氧化还原调节组合物中，谷胱甘肽前体组分的浓度为1.5mm，还原性组分的浓度为75μm，能量代谢底物组分的浓度为3mm。

44、本发明通过向基础培养基中添加分泌诱导因子组合物、膜合成与囊泡生成组合物、代谢与氧化还原调节组合物，使该培养基从信号激活（分泌诱导因子组合物）、原料供应（膜合成与囊泡生成组合物）和代谢支持（代谢与氧化还原调节组合物）三个维度协同作用，有效提升细胞分泌功能。本发明无血清诱导培养基以“促进细胞分泌”为核心功能，使培养基从传统“促增殖”转变为“促增殖+促分泌”的复合功能，所述培养基可在不牺牲细胞增殖和表型维持的前提下，显著提升单位细胞的分泌产量。

45、本发明第二方面，在于提供一种利用本发明第一方面所述无血清诱导培养基进行干细胞培养的方法，所述培养方法包括以下步骤：

46、步骤1、将人间充质干细胞接种于培养容器中，加入所述无血清诱导培养基进行培养；

47、步骤2、培养过程中，不断更换新鲜的无血清诱导培养基，培养至细胞融合度达80%～90%，进行传代培养或用于后续产物纯化。

48、以下对上述步骤进行具体描述。

49、步骤1中，将人间充质干细胞以3000～5000cells/cm2的密度接种于培养容器中。

50、优选地，将人间充质干细胞以4000cells/cm2的密度接种于培养容器中。

51、加入所述无血清诱导培养基在35～37℃、4～6%co2条件下进行培养。

52、优选地，加入所述无血清诱导培养基在37℃、5%co2条件下进行培养。

53、步骤2中，每隔2～3天更换新鲜的所述无血清诱导培养基，待细胞融合度达80%～90%时进行传代培养或收集培养上清用于后续产物纯化。

54、在进行传代培养和收集上清用于后续产物纯化前24～48h，添加1～5mm的atp或其类似物，用于分泌增强脉冲刺激。

55、优选地，在进行传代培养和收集上清用于后续产物纯化前36h，添加3mm的atp或其类似物。

56、本发明所述无血清诱导培养基的使用方法高度适配本发明无血清诱导培养基的分泌诱导特性。该使用方法通过控制细胞融合度80%～90%收获产物，可规避细胞过度密集导致的代谢抑制与分泌能力下降问题，在保障细胞可正常传代、持续扩增的基础上，最大化富集细胞分泌产物。该使用方法和培养基相配合可进一步固化高分泌效果，提升干细胞分泌组产物产出稳定性与重复性。

57、本发明所具有的有益效果：

58、（1）本发明所述无血清诱导培养基包括基础培养基、分泌诱导因子组合物、膜合成与囊泡生成组合物、代谢与氧化还原调节组合物。其中分泌诱导因子组合物用于分泌信号激活并促进囊泡生成与释放、膜合成与囊泡生成组合物用于给囊泡结构提供原料供给、代谢与氧化还原调节组合物用于细胞分泌过程的稳态维持，上述基础培养基和各组合物精准分工、协同作用，从干细胞分泌的基因调控、信号传导、结构合成、能量代谢方面实现系统化调控，使该无血清诱导培养基在不影响干细胞干性维持的前提下，兼具细胞增殖快和分泌功能强的优点，解决了现有技术培养基仅能单一促进细胞增殖，无法同时兼顾细胞增殖、干性维持与高效分泌功能的缺点。

59、本发明所述无血清诱导培养基采用化学成分明确的重组蛋白与小分子化合物，无动物血清及异源未知杂质，批次稳定性好、安全性高。

60、（2）本发明所述基础培养基采用特定用量范围的重组胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、重组人白蛋白等化学组分进行复配，可在完全无动物血清的环境下，维持人间充质干细胞的葡萄糖代谢、氧化还原平衡、渗透压稳定、氨基酸合成代谢与增殖能力。限定的各组分的浓度范围可规避组分过量毒性或剂量不足导致的细胞生长不良等问题，确保干细胞在长期传代培养过程中形态均一、增殖稳定、无分化逃逸，干性表型稳定，为后续高强度分泌诱导提供健康、稳定的细胞状态基础，解决了常规无血清培养基易出现细胞活性下降、干性丢失、批次不稳定的缺陷。

61、（3）本发明分泌诱导因子组合物包括促囊泡生成组分、促进膜合成组分、增强蛋白合成组分、促进囊泡释放组分、调节基因表达组分，并限定各组分的有效浓度区间。其中促囊泡生成组分bfgf可精准激活mapk/erk通路以启动囊泡生成；促进膜合成组分可保障细胞膜合成与重构；增强蛋白合成组分可强化细胞蛋白合成与代谢活性；促进囊泡释放组分可优化细胞膜流动性、促进成熟囊泡向外释放；调节基因表达组分能从基因层面稳定干细胞分泌表型。上述各组分在本发明限定的浓度范围内，可在不改变细胞干性的前提下，持续、稳定激活干细胞分泌程序，使单位细胞囊泡及功能性细胞因子产量显著提升。

62、（4）现有技术公开的培养基忽视干细胞囊泡生成的原料需求，仅依靠细胞内源合成，导致囊泡生成效率极低。本发明通过设置特定浓度范围的膜合成组分、膜磷脂合成组分、脂肪酸提供组分，其中，膜合成组分为囊泡出芽提供核心膜原料；膜磷脂合成组分用于保障膜磷脂结构完整与脂筏形成；脂肪酸提供组分用于补充必需脂肪酸。该膜合成与囊泡生成组合物从原料端支撑囊泡合成、膜重构与囊泡运输过程，解决了高强度分泌过程中细胞膜原料不足、囊泡生成受限的问题。

63、（5）本发明所述代谢与氧化还原调节组合物包括特定浓度的谷胱甘肽前体组分、还原性组分、能量代谢底物组分，所述代谢与氧化还原调节组合物中的谷胱甘肽前体组分可高效清除胞内氧自由基，降低氧化应激；还原性组分用于维持培养体系的还原性环境，保护分泌组活性分子不被氧化灭活；能量代谢底物组分用于补充高强度分泌所需能量底物，避免细胞能量匮乏导致的分泌停滞与细胞凋亡。该组合物可确保细胞在持续高分泌状态下维持代谢稳态，既可提升分泌组的分泌产量，又可以显著提升分泌组产物的生物活性与保存稳定性。