柔毛淫羊藿WRKY转录因子EpWRKY19、编码基因和应用的制作方法

本发明属于基因工程应用，涉及一种核心功能在于提高植物干旱耐受性的柔毛淫羊藿wrky转录因子，具体涉及柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19及其编码基因和应用。

背景技术：

1、柔毛淫羊藿

epimedium pubescens maxim.）为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。淫羊藿的主要药用活性成分为黄酮醇苷类成分，其含量直接决定了药材品质。现代药理研究表明，淫羊藿在补肾壮阳、抗氧化、抗骨质疏松及改善心血管功能等方面具有重要作用。柔毛淫羊藿喜阴湿环境，对水分条件要求较高，尤其是在生殖生长与营养生长关键期，常遭遇季节性干旱胁迫，导致叶片灼伤、生长停滞甚至植株死亡，严重影响淫羊藿的药材品质与产量。

2、wrky转录因子是植物体内一类重要的转录因子家族，广泛参与调控植物的生长发育、代谢过程及生物、非生物胁迫应答。研究表明，wrky转录因子在植物应对干旱、盐害、低温等非生物胁迫中发挥着重要的调控功能。然而，其在柔毛淫羊藿响应干旱胁迫中的具体功能尚不清楚。

技术实现思路

1、为了填补柔毛淫羊藿

epwrky19基因的克隆、表达模式、功能分析以及柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的空白，本发明提供了柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的核苷酸编码序列及氨基酸序列，蛋白亚细胞定位，抵抗干旱胁迫的功能，为今后利用基因工程技术调控

epwrky19基因表达，提高柔毛淫羊藿干旱胁迫抗性提供了理论依据。

2、一方面，本发明提供了具有降低叶片失水率从而提高植株干旱胁迫抗性的柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19，上述wrky转录因子epwrky19包括具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的多肽蛋白质）；或由seq id no.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19特征的蛋白质。

3、另一方面，本发明提供一种编码上述柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因，上述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1第1~1440位所示。

4、在本发明中，“分离的dna”、“纯化的dna”是指，该dna或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该dna或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

5、在本发明中，柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因，是指编码具有柔毛淫羊藿蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如seq id no.1所示的第1～1440位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于seq id no.1所示的第1～1440位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与seq id no.1所示的第1～1440位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出seq id no.2所示的序列。上述编码基因还可以指与seq id no.1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。

6、本发明的柔毛淫羊藿

epwrky19基因相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

7、本发明还提供一种重组表达载体，其包含上述柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因。上述重组表达载体为epwrky19-gfp。

8、本发明还提供一种上述柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因在提高柔毛淫羊藿耐干旱性中的应用，通过过表达上述编码基因，降低叶片失水率。

9、有益效果：柔毛淫羊藿作为传统名贵中药材，市场需求大，是《中华人民共和国药典》收录的淫羊藿主要基原物种。本发明首次克隆了柔毛淫羊藿中wrky转录因子epwrky19的编码序列，并利用烟草叶片表皮细胞瞬时表达分析了转录因子epwrky19蛋白的亚细胞定位；组织表达试验结果显示，

epwrky19基因存在明显的组织表达特异性，在茎、叶中的表达量显著高于根部；烟草离体叶片失水率试验表明，失水180min后，过表达

epwrky19基因能显著降低叶片失水率，有效提高植物的耐旱性。上述研究为运用基因工程技术调控

epwrky19基因的表达，从而增强柔毛淫羊藿的抗旱性、保障产量与品质，以及选育高抗逆性新品种提供了理论依据与技术支撑，具有重要的应用前景。

1.一种柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19，其特征在于，所述转录因子epwrky19的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2. 一种编码权利要求1所述的柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因，其特征在于，所述编码基因为如seq id no.1所示的核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为epwrky19-gfp。

5.一种权利要求2所述的柔毛淫羊藿wrky转录因子epwrky19的编码基因在提高柔毛淫羊藿耐干旱性中的应用，其特征在于，通过过表达所述编码基因，降低叶片失水率。