经改造的腺相关病毒(AAV)及其用途

本发明属于生物医药领域，涉及经改造的腺相关病毒(aav)及其用途。

背景技术：

1、基因治疗通过向患者体内引入正常基因来修复或替代缺陷基因，从而治疗一些无法通过传统药物或手术治疗的疾病，得益于极高的生物安全性、高效的基因转导和持续表达时间以及广泛组织靶向性，aav被认为是体内基因治疗最有效的递送载体。目前全球已上市的aav基因疗法有7款，进入临床阶段的aav相关试验已达到了388项，aav作为基因治疗首选的明星载体被广泛应用于眼科疾病、神经退行性疾病、肌肉疾病以及心血管疾病等治疗领域。

2、而如何实现aav 病毒载体疾病靶向性的基因递送是基因治疗领域关注的焦点，目前可用的aav 靶向性修饰的策略包括：基于定向进化aav 衣壳蛋白文库的组织筛选、融合纳米抗体导向的aav 衣壳改造、小分子配体化学修饰aav，衣壳的改造，以及其他物种中新型血清型aav 的发现等。定向进化策略依赖于在动物组织中进行大量aav 衣壳蛋白文库的筛选，由于物种间的组织差异，无法将进化得到的aav 直接转化到灵长类动物和人类中。通过融合表达或化学修饰靶向功能的配体可以增加aav 在特定靶点的富集，但融合表达会影响aav 结构的稳定性和侵染活性。化学修饰小分子配体主要与衣壳蛋白上亲核性的氨基酸残基偶联，随机、不可控的化学修饰会影响aav 的侵染，内体逃逸以及入核，进而严重降低基因转染效率。

技术实现思路

1、本发明以非天然氨基酸定点修饰为技术基础，结合蛋白质前药的设计理念对aav病毒衣壳蛋白进行定点化学修饰，改造后的aav 病毒在非靶组织处于惰性-非活性形式，仅在特殊病理微环境（金属蛋白酶，组织蛋白酶，ros）或者外源（光，超声等）刺激下转化为活性形式，以实现对特定疾病组织的靶向基因治疗。由此提供了以下方面。

2、经改造的aav

3、在第一方面，本发明提供了一种经改造的腺相关病毒(aav)，其包含经修饰的腺相关病毒(aav)衣壳蛋白，所述经修饰的aav衣壳蛋白具有至少一个连接有偶联部分的非天然氨基酸残基，所述偶联部分通过可裂解连接子（cleavable linker）共价连接至所述非天然氨基酸残基，所述非天然氨基酸残基衍生自含有四嗪基团的非天然氨基酸（即四嗪非天然氨基酸）。

4、在某些实施方案中，所述含有四嗪基团的非天然氨基酸具有式i所示的化学结构：

5、（式i）

6、其中，r1选自h、卤素、羟基、氰基、c1-6烷基、c1-6卤代烷基、c1-6烷氧基、c6-c10芳香基、5至10元杂芳基，优选地，r1选自甲基、乙基、异丙基、正丁基、苯基、4-吡啶基；

7、l1选自直接键、ch2、nh2、o、s，m为选自1至6的整数；优选地，l1为ch2，m为1；

8、l2选自c6-c10芳香亚基，n为选自0至3的整数；优选地，l2选自1,2-亚苯基、1,3-亚苯基、1,4-亚苯基，n为0或1；最优选地，l2为1,3-亚苯基，n为0或1。

9、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸选自以下中的任一项：

10、；

11、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸为mpet。

12、在某些实施方案中，所述连接有偶联部分的非天然氨基酸残基具有式ii-1或式ii-2所示的化学结构：

13、（式ii-1）、（式ii-2）

14、其中，所述非天然氨基酸残基位于衣壳蛋白氨基酸序列的第n位，由标号1到标号2的方向为氨基酸序列的n末端到c末端方向，标号1表示衣壳蛋白氨基酸序列的第1至n-1位氨基酸残基，标号2表示衣壳蛋白氨基酸序列的第n+1位至c末端的氨基酸残基；

15、r1选自h、卤素、羟基、氰基、c1-6烷基、c1-6卤代烷基、c1-6烷氧基、c6-c10芳香基、5至10元杂芳基，优选地，r1选自甲基、乙基、异丙基、正丁基、苯基、4-吡啶基；

16、l1选自直接键、ch2、nh2、o、s，m为选自1至6的整数；优选地，l1为ch2，m为1；

17、l2选自c6-c10芳香亚基，n为选自0至3的整数；优选地，l2选自1,2-亚苯基、1,3-亚苯基、1,4-亚苯基，n为0或1；最优选地，l2为1,3-亚苯基，n为0或1；

18、x选自直接键、醚键、、、、、；优选地，x选自、、，其中1处连接环辛烷上的碳原子，2位连接l3；

19、l3为可裂解连接子；

20、m为偶联部分。

21、在某些实施方案中，所述偶联部分包含掩蔽部分（mask moiety）。

22、在某些实施方案中，所述掩蔽部分选自聚合物，例如合成聚合物（如peg）或多肽聚合物如（如xten蛋白）。

23、在某些实施方案中，所述掩蔽部分选自peg，例如分子量为5k~40k，如5k、10k、20k或40k。在某些实施方案中，所述掩蔽部分选自分子量为20k的peg。

24、在某些实施方案中，所述掩蔽部分选自xten蛋白。在某些实施方案中，所述xten蛋白可包含5至14个(例如9至14个)氨基酸残基的一个或多个序列基序，其中所述基序包含选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)的4至6种类型的氨基酸(例如5种氨基酸)，基本上由所述氨基酸组成或者由所述氨基酸组成，例如可参见us2010/0239554a1。在某些实施方案中，所述xten蛋白的长度为100aa~500aa，例如120aa~500aa，130aa~500aa，140aa~450aa，例如144aa、288aa、432aa。在某些实施方案中，所述xten蛋白包含seq id nos: 11-13任一项所示的序列。在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含至少1个拷贝（如1个拷贝）的酶切位点序列。

25、在某些实施方案中，所述掩蔽部分选自aavr胞外结构域，例如pkd1（如seq id no:14）和/或pkd2（如seq id no: 15）。在某些实施方案中，所述掩蔽部分包含pkd1和pkd2，如seq id no: 16。在某些实施方案中，所述掩蔽部分包含pkd2，如seq id no: 15。在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含至少1个拷贝（如串联3个拷贝）的酶切位点序列。

26、在某些实施方案中，所述掩蔽部分包含xten蛋白和aavr胞外结构域的融合蛋白。在某些实施方案中，所述融合蛋白从n端至c端包含：（a）aavr胞外结构域（例如pkd1和pkd2，或pkd2）、xten蛋白（例如seq id no: 11），所述xten蛋白的c端连接酶切位点序列；或（b）aavr胞外结构域（例如pkd1和pkd2，或pkd2）、第一拷贝的酶切位点序列、xten蛋白（例如seqid no: 11），所述xten蛋白的c端连接第二拷贝的酶切位点序列；或（c）aavr胞外结构域（例如pkd1和pkd2，或pkd2）、第一拷贝的酶切位点序列、xten蛋白的第一片段（例如seq id no:11的aa1-72）、第二拷贝的酶切位点序列、xten蛋白的第二片段（例如seq id no: 11的aa73-144）、以及第三拷贝的酶切位点序列。

27、在某些实施方案中，所述偶联部分还包含与所述掩蔽部分连接的靶向部分（例如抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物如affibody）。在某些实施方案中，所述靶向部分位于所述偶联部分的n端。在某些实施方案中，所述偶联部分包含n端连接有靶向部分（例如抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物如affibody）的xten蛋白。在某些实施方案中，所述偶联部分包含n端连接有affibody的xten蛋白。在某些示例性实施方案中，所述偶联部分包含seq id no: 11所示的xten蛋白以及连接至其n端的affibody。在某些示例性实施方案中，所述affibody包含seq id no: 17所示的序列。

28、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由病理微环境中的因子（如金属蛋白酶、组织蛋白酶、活性氧(ros)）或者外源刺激（如光、超声）裂解。

29、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由活性氧(ros)裂解，例如包含硼酸基团或硼酸酯基团。

30、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由光漂白裂解，例如包含荧光基团。在某些实施方案中，所述可裂解连接子由近红外光诱导的光漂白裂解，例如包含cy7。

31、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由蛋白酶裂解，例如包含酶切位点序列。在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含至少一个（例如1个、2个、3个）酶切位点序列。

32、在某些实施方案中，所述蛋白酶为ii型跨膜丝氨酸蛋白酶（matriptase-2）、corin蛋白酶、金属基质蛋白酶（mmp）或尿激酶-型纤溶酶原激活剂（upa）。

33、在某些实施方案中，matriptase-2的酶切位点序列包含seq id nos: 20-27任一项所示的序列。在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含1个、2个、3个matriptase-2的酶切位点序列（例如seq id no: 27）。在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含3个串联的seq id no: 27所示的matriptase-2的酶切位点序列。

34、在某些实施方案中，corin的酶切位点序列包含seq id nos: 28-34任一项所示的序列。

35、在某些实施方案中，mmp的酶切位点序列包含seq id nos: 35-36任一项所示的序列。

36、在某些实施方案中，upa的酶切位点序列包含seq id no: 42所示的序列。

37、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由糖苷酶（如β-glucuronidase）裂解，例如包含葡糖醛酸基团。

38、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由活性氧(ros)裂解，并且包含以下结构：

39、，其中1处连接x，2处连接m。

40、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由近红外光诱导的光漂白裂解，并且包含以下结构：

41、，其中1处连接x，2处连接m。

42、在某些实施方案中，所述可裂解连接子由蛋白酶裂解，并且包含以下结构：

43、、（式a）或（式b），其中1处连接x，2处连接m；cs为酶切位点序列。优选地，当m为合成聚合物如peg时，所述可裂解连接子包含式a所示的结构。优选地，当m为多肽聚合物如xten或蛋白如aavr时，所述可裂解连接子包含式b所示的结构。

44、在某些实施方案中，m-l3-x选自：

45、、、、。

46、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸残基位于对应于以下位置的位点上：

47、(a)seq id no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的s268、q327、s448、t453、l462、t583、l585，例如q327、t453、l585，例如l585；

48、(b)seq id no: 7所示的aav9衣壳蛋白氨基酸序列的g453、g455、s499、a591、h584，例如g455、s499、h584，例如h584；

49、(c)seq id no: 9所示的aav-php-eb衣壳蛋白氨基酸序列的h584；

50、(d) seq id no: 10所示的aav8衣壳蛋白氨基酸序列的s266, q328, s449,q461, l463, d584, l586, q588, t591, q594；例如d584, l586；或

51、(e) seq id no: 43所示的aav5衣壳蛋白氨基酸序列的 d374，t444，a579，例如a579。

52、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸残基位于对应于以下位置的位点上：seqid no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的l585；seq id no: 7所示的aav9衣壳蛋白氨基酸序列的h584；seq id no: 9所示的aav-php-eb衣壳蛋白氨基酸序列的h584；seq idno: 10所示的aav8衣壳蛋白氨基酸序列的d584；或，seq id no: 43所示的aav5衣壳蛋白氨基酸序列的a579。

53、在某些实施方案中，所述aav选自任意的血清型，例如aav-dj型、aav9型、aav-php-eb型、aav5型、aav2型或aav8型。

54、在某些实施方案中，所述经改造的aav进一步包含目的核酸载荷（a nucleic acidpayload of interest）。

55、在某些实施方案中，所述目的核酸载荷选自治疗基因（例如抗体、疫苗、细胞因子如血管生成细胞因子、激素如松弛素、凝血因子、生长因子、酶、rna干扰剂如shrna、基因编辑工具如crispr/cas系统，例如）或报告基因（例如，荧光蛋白或荧光素酶）。

56、在某些实施方案中，所述目的核酸载荷可操作地连接至启动子，并且其两端为反向末端重复序列(itr)。

57、在某些示例性实施方案中，位于aav衣壳蛋白第n位的连接有偶联部分的非天然氨基酸残基具有式iv-1或式iv-2所示的结构：

58、（式iv-1）或

59、（式iv-2）；

60、其中：

61、m为偶联部分，优选为合成聚合物，如peg（例如分子量为5k~40k，例如5k、10k、20k或40k）；

62、aav选自任意血清型，例如aav-dj型、aav9型、aav-php-eb型、aav5型、aav2型或aav8型；优选地，aav为：aav-dj，所述第n位相应于seq id no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的l585；或aav9，所述第n位相应于seq id no: 7所示的aav9衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav-php-eb，所述第n位相应于seq id no: 9所示的aav-php-eb衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav8，所述第n位相应于seq id no:10所示的aav8衣壳蛋白氨基酸序列的d584；或aav5，所述第n位相应于seq id no:43所示的aav5衣壳蛋白氨基酸序列的a579。

63、在某些示例性实施方案中，位于aav衣壳蛋白第n位的连接有偶联部分的非天然氨基酸残基具有式v-1或式v-2所示的结构：

64、（式v-1）或

65、（式v-2）；

66、其中：

67、m为偶联部分，优选为合成聚合物，如peg（例如分子量为5k~40k，例如5k、10k、20k或40k）；

68、aav选自任意血清型，例如aav-dj型、aav9型、aav-php-eb型、aav5型、aav2型或aav8型；优选地，aav为：aav-dj，所述第n位相应于seq id no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的l585；或aav9，所述第n位相应于seq id no: 7所示的aav9衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav-php-eb，所述第n位相应于seq id no: 9所示的aav-php-eb衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav8，所述第n位相应于seq id no:10所示的aav8衣壳蛋白氨基酸序列的d584；或aav5，所述第n位相应于seq id no:43所示的aav5衣壳蛋白氨基酸序列的a579。

69、在某些示例性实施方案中，位于aav衣壳蛋白第n位的连接有偶联部分的非天然氨基酸残基具有式vi-1或式vi-2所示的结构：

70、（式vi-1）或

71、（式vi-2）；

72、其中：

73、m为偶联部分，优选为合成聚合物，如peg（例如分子量为5k~40k，例如5k、10k、20k或40k）；

74、aav选自任意血清型，例如aav-dj型、aav9型、aav-php-eb型、aav5型、aav2型或aav8型；优选地，aav为：aav-dj，所述第n位相应于seq id no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的l585；或aav9，所述第n位相应于seq id no: 7所示的aav9衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav-php-eb，所述第n位相应于seq id no: 9所示的aav-php-eb衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav8，所述第n位相应于seq id no:10所示的aav8衣壳蛋白氨基酸序列的d584；或aav5，所述第n位相应于seq id no:43所示的aav5衣壳蛋白氨基酸序列的a579；

75、cs为酶切位点序列，例如seq id no: 20-27任一项所示的matriptase-2酶切位点序列，seq id no: 28-34任一项所示的corin酶切位点序列，seq id no: 35或36所示的mmp酶切位点序列；优选地，cs选自seq id no: 27所示的matriptase-2酶切位点序列，seq idno: 28所示的corin酶切位点序列，或seq id no: 35所示的mmp酶切位点序列；更优选地，cs为seq id no: 27所示的matriptase-2酶切位点序列；优选地，cs为一个拷贝的酶切位点序列。

76、在某些示例性实施方案中，位于aav衣壳蛋白第n位的连接有偶联部分的非天然氨基酸残基具有式vii-1或式vii-2所示的结构：

77、（式vii-1）或

78、（式vii-2）；

79、其中：

80、m为偶联部分，优选为蛋白或多肽聚合物，如peg（例如分子量为5k~40k，例如5k、10k、20k或40k）；优选地，m选自（i）-（iv）：

81、（i）xten，例如seq id nos: 11-13任一项所示的序列；优选地其中，cs为至少1个拷贝（如1个拷贝）的酶切位点序列；

82、（ii）aavr胞外结构域，例如pkd1和/或pkd2；优选地其中，cs为至少1个拷贝（如串联3个拷贝）的酶切位点序列；

83、（iii）aavr胞外结构域（例如pkd1和/或pkd2）以及xten蛋白（例如seq id nos:11-13任一项所示的序列）的融合蛋白，所述融合蛋白从n端至c端包含：（a）aavr胞外结构域（例如pkd1和pkd2，或pkd2）、xten蛋白（例如seq id no: 11），所述xten蛋白的c端连接酶切位点序列；或（b）aavr胞外结构域（例如pkd1和pkd2，或pkd2）、第一拷贝的酶切位点序列、xten蛋白（例如seq id no: 11），所述xten蛋白的c端连接第二拷贝的酶切位点序列；或（c）aavr胞外结构域（例如pkd1和pkd2，或pkd2）、第一拷贝的酶切位点序列、xten蛋白的第一片段（例如seq id no: 11的aa1-72）、第二拷贝的酶切位点序列、xten蛋白的第二片段（例如seq id no: 11的aa73-144）、以及第三拷贝的酶切位点序列；

84、（iv）n端连接有靶向部分（如例如抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物如affibody）的xten（例如seq id nos: 11-13任一项所示的序列）；优选地，靶向部分为affibody，例如靶向her2的affibody（如seq id no: 17）；优选地其中，cs为至少1个拷贝（如1个拷贝）的酶切位点序列；

85、aav选自任意血清型，例如aav-dj型、aav9型、aav-php-eb型、aav5型、aav2型或aav8型；优选地，aav为：aav-dj，所述第n位相应于seq id no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的l585；或aav9，所述第n位相应于seq id no: 7所示的aav9衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav-php-eb，所述第n位相应于seq id no: 9所示的aav-php-eb衣壳蛋白氨基酸序列的h584；或aav8，所述第n位相应于seq id no:10所示的aav8衣壳蛋白氨基酸序列的d584；或aav5，所述第n位相应于seq id no:43所示的aav5衣壳蛋白氨基酸序列的a579；

86、cs为酶切位点序列，例如seq id no: 20-27任一项所示的matriptase-2酶切位点序列，seq id no: 28-34任一项所示的corin酶切位点序列，seq id no: 35或36所示的mmp酶切位点序列；优选地，cs选自seq id no: 27所示的matriptase-2酶切位点序列，seq idno: 28所示的corin酶切位点序列，或seq id no: 35所示的mmp酶切位点序列。

87、制备经改造的aav的方法

88、在第二方面，本发明提供了一种制备经改造的腺相关病毒(aav)的方法，其包括以下步骤：

89、-提供：（1）掺入非天然氨基酸的腺相关病毒(aav)，其包含定点突变的衣壳蛋白，所述定点突变的衣壳蛋白具有至少一个含有四嗪基团的非天然氨基酸残基；（2）连接有反式环辛烯（tco）基团的偶联部分，其中所述偶联部分通过可裂解连接子（cleavablelinker）连接至tco基团；

90、-将（1）与（2）共孵育，通过逆电子需求diels-alder（iedda）反应将所述非天然氨基酸与偶联部分偶联。

91、在某些实施方案中，所述iedda反应条件为常温，例如20~30°c，例如25°c。在某些实施方案中，在磷酸盐缓冲液（pbs）中于25°c条件下进行孵育。

92、在某些实施方案中，所述偶联部分如第一方面中定义。

93、在某些实施方案中，所述可裂解连接子如第一方面中定义。

94、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸残基的位置如第一方面中定义。

95、在某些实施方案中，所述aav选自任意的血清型，例如aav-dj型、aav9型、aav-php-eb型、aav5型、aav2型或aav8型。

96、在某些实施方案中，所述含有四嗪基团的非天然氨基酸具有式i所示的化学结构：

97、（式i）

98、其中，r1选自h、卤素、羟基、氰基、c1-6烷基、c1-6卤代烷基、c1-6烷氧基、c6-c10芳香基、5至10元杂芳基，优选地，r1选自甲基、乙基、异丙基、正丁基、苯基、4-吡啶基；

99、l1选自直接键、ch2、nh2、o、s，m为选自1至6的整数；优选地，l1为ch2，m为1；

100、l2选自c6-c10芳香亚基，n为选自0至3的整数；优选地，l2选自1,2-亚苯基、1,3-亚苯基、1,4-亚苯基，n为0或1；最优选地，l2为1,3-亚苯基，n为0或1。

101、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸选自以下中的任一项：

102、；

103、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸为mpet。

104、在某些实施方案中，所述连接有反式环辛烯（tco）基团的偶联部分具有式iii所示的化学结构：

105、（式iii）

106、其中，x选自直接键、醚键、、、、、；

107、优选地，x选自、、，其中1处连接反式环辛烯的4位碳原子，2位连接l3；

108、l3为可裂解连接子；

109、优选地，l3选自、、、，其中1处连接x，2处连接m；cs为酶切位点序列；

110、m为偶联部分。

111、在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含硼酸基团，所述连接有反式环辛烯（tco）基团的偶联部分为：，m为偶联部分，例如peg。

112、在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含cy7，所述连接有反式环辛烯（tco）基团的偶联部分为：，m为偶联部分，例如peg。

113、在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含酶切位点序列，所述连接有反式环辛烯（tco）基团的偶联部分为：，其中cs为酶切位点序列，m为偶联部分，例如peg。

114、在某些实施方案中，所述可裂解连接子包含酶切位点序列，所述连接有反式环辛烯（tco）基团的偶联部分为：，其中cs为酶切位点序列，m为偶联部分，例如xten或蛋白。

115、在某些实施方案中，通过以下步骤提供所述掺入非天然氨基酸的aav：

116、(a) 提供：(i) aav包装系统，所述aav包装系统包含编码所述定点突变的衣壳蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子，其中所述核苷酸序列在对应于所述非天然氨基酸的位置的密码子为终止密码子（例如tag或taa）；(ii)编码正交氨酰trna合成酶的第二核酸分子；(iii)编码正交trna的第三核酸分子；优选地，所述正交氨酰trna合成酶用含有四嗪基团的非天然氨基酸酰胺化所述正交trna；

117、(b) 将所述aav包装系统、第二核酸分子和第三核酸分子同时或以任意顺序依次引入（例如转化、转导或转染）至宿主细胞（例如hek-293t细胞）；

118、(c) 在含有非天然氨基酸的培养基中培养步骤(b)获得的宿主细胞，以获得所述掺入非天然氨基酸的aav。

119、在某些实施方案中，所述aav包装系统包含：（i）包含rep基因和cap基因的包装质粒，所述cap基因为第一核酸分子；（ii）包含腺病毒辅助基因（e2a、e4、va rna）的辅助质粒；（iii）包含目的核酸载荷（a nucleic acid payload of interest）的外源基因表达质粒。

120、在某些实施方案中，所述第二核酸分子和第三核酸分子存在于同一载体例如不同的表达盒，或者存在于不同载体。在某些实施方案中，所述第二核酸分子任选地可操作地连接至调控元件，例如启动子，例如组成型启动子，例如cmv、ef1α、cag、ubc启动子。在某些实施方案中，所述第三核酸分子任选地可操作地连接至调控元件，例如启动子，例如rna聚合酶iii启动子，如u6启动子或h1启动子。

121、在某些实施方案中，目的核酸载荷可操作地连接至启动子，并且位于两端的反向末端重复序列(itr)之间。

122、在某些实施方案中，所述正交氨酰trna合成酶识别四嗪非天然氨基酸（例如mptet），并用四嗪非天然氨基酸（例如mptet）酰胺化所述正交trna，所述正交trna的反密码子为终止密码子的反向互补物（例如，tag的反向互补物为cua）。由此，所述正交氨酰trna合成酶将非天然氨基酸装载到正交trna上，并随后将所述非天然氨基酸在对应于所述终止密码子的位置处掺入到所述蛋白中。

123、在某些实施方案中，所述正交氨酰trna合成酶包含seq id no: 1所示的序列。在某些实施方案中，所述正交trna的反密码子为终止密码子的反向互补物（例如，tag的反向互补物为cua）。在某些实施方案中，所述正交trna包含seq id no: 2所示的序列。

124、经改造aav的应用

125、在第三方面，本发明提供了一种用于向受试者递送目的核酸载荷（a nucleicacid payload of interest）的方法，其包括向所述受试者施用第一方面所述的经改造的aav。还提供了第一方面所述的经改造的aav用于向受试者递送目的核酸载荷（a nucleicacid payload of interest）的用途，以及在制备用于向受试者递送目的核酸载荷（anucleic acid payload of interest）的试剂中的用途。

126、在某些实施方案中，向受试者的炎症或感染组织（例如肝脏组织，如肝纤维化；或心脏组织，如心脏缺血再灌注；或肺组织，如肺纤维化、肺炎或者急性肺损伤）递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由活性氧(ros)裂解，例如包含硼酸基团或硼酸酯基团；优选地，所述aav为aav-dj、aav9或aav5。

127、在某些实施方案中，向受试者的肝脏组织如肝纤维化递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由活性氧(ros)裂解，例如包含硼酸基团或硼酸酯基团；优选地，所述aav为aav-dj。

128、在某些实施方案中，向受试者的心脏组织如心脏缺血再灌注递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由活性氧(ros)裂解，例如包含硼酸基团或硼酸酯基团；优选地，所述aav为aav9。

129、在某些实施方案中，向受试者的肺组织如肺纤维化、肺炎或者急性肺损伤递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由活性氧(ros)裂解，例如包含硼酸基团或硼酸酯基团；优选地，所述aav为aav5。

130、在某些实施方案中，向受试者的肝脏组织递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由蛋白酶裂解，例如包含matriptase2蛋白酶酶切位点序列；优选地，所述aav为aav8或aav-dj。

131、在某些实施方案中，向受试者的心脏组织递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由蛋白酶裂解，例如包含corin蛋白酶酶切位点序列；优选地，所述aav为aav9。

132、在某些实施方案中，向受试者的肿瘤组织递送所述目的核酸载荷；优选地，所述可裂解连接子由蛋白酶裂解，例如包含金属基质蛋白酶（mmp）酶切位点序列；优选地，所述偶联部分包含xten蛋白；优选地，所述偶联部分包含靶向肿瘤细胞的靶向部分（如affibody）；优选地，所述偶联部分包含xten蛋白以及连接至其n端的靶向肿瘤细胞的靶向部分（如affibody）；优选地，所述aav为aav-dj。

133、在某些实施方案中，向受试者的肌肉组织递送所述目的核酸载荷；优选地，所述aav为aav9；优选地，所述可裂解连接子由光漂白裂解，例如包含荧光基团，例如cy7；优选地，所述方法还包括在肌肉处给予近红外光照。

134、在某些实施方案中，向受试者的脑组织递送所述目的核酸载荷；优选地，所述aav为php-eb；优选地，所述可裂解连接子由光漂白裂解，例如包含荧光基团，例如cy7；优选地，所述方法还包括在头部给予近红外光照。

135、在某些实施方案中，所述经改造的aav在受试者中表现出降低的体液免疫水平。所述降低的体液免疫水平是指与施用相应型别的野生型aav或未经本文所述的改造的相应型别aav相比，所诱导机体产生的抗aav总抗体或中和抗体降低。

136、在某些实施方案中，所述受试者存在预存抗aav抗体（例如中和抗体）。

137、在某些实施方案中，所述受试者经历过aav基因治疗。

138、在某些实施方案中，所述受试者为人。

139、在某些实施方案中，所述经改造的aav通过注射给药（injection）、气管内给药（intratracheal）、鼻腔内给药（intranasal）、或吸入给药（inhalation）。

140、在某些实施方案中，所述目的核酸载荷为治疗基因，例如抗体、疫苗、细胞因子如血管生成细胞因子、激素如松弛素、凝血因子、生长因子、酶、rna干扰剂如shrna、基因编辑工具如crispr/cas系统。在某些实施方案中，所述目的核酸载荷为报告基因。

141、在第四方面，本发明提供了一种用于在受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用第一方面所述的经改造的aav。还提供了第一方面所述的经改造的aav用于在受试者中治疗疾病，以及在制备用于在受试者中治疗疾病的药物中的用途。

142、在某些实施方案中，所述经改造的aav包含的目的核酸载荷选自治疗基因（例如抗体、疫苗、细胞因子如血管生成细胞因子、激素如松弛素、凝血因子、生长因子、酶、rna干扰剂如shrna、基因编辑工具如crispr/cas系统。在某些实施方案中，所述治疗基因编码治疗所述疾病的生物活性分子。

143、在某些实施方案中，所述方法包括使用第三方面所述的方法向受试者递送目的核酸载荷以治疗疾病。

144、在某些实施方案中，所述经改造的aav在受试者中表现出降低的体液免疫水平。所述降低的体液免疫水平是指与施用相应型别的野生型aav或未经本文所述的改造的相应型别aav相比，所诱导机体产生的抗aav总抗体或中和抗体降低。

145、在某些实施方案中，所述受试者存在预存抗aav抗体（例如中和抗体）。

146、在某些实施方案中，所述受试者经历过aav基因治疗。

147、在某些实施方案中，所述受试者为人。

148、筛选可掺入非天然氨基酸的位点

149、在第五方面，本发明提供了一种用于筛选腺相关病毒(aav)衣壳蛋白中可掺入非天然氨基酸的位点的方法，所述方法包括：

150、(a) 提供：(i)第一经改造的aav，其在衣壳蛋白的预设位点上具有非天然氨基酸残基；(ii)第二经改造的aav，其在衣壳蛋白的所述预设位点上具有连接有封闭基团（如peg）的非天然氨基酸残基；(iii)第三经改造的aav，其在衣壳蛋白的所述预设位点上具有连接有氨基基团的非天然氨基酸残基；其中，(i)-(iii)中所述非天然氨基酸为含有四嗪基团的非天然氨基酸；

151、(b) 将第一经改造的aav、第二经改造的aav和第三经改造的aav分别与细胞（例如hek-293t细胞）进行孵育并检测对细胞的感染活性；其中，当第一经改造的aav与第三经改造的aav的感染活性相当，且第二经改造的aav对细胞呈现微弱或不可检测的感染活性时，选择该预设位点作为掺入非天然氨基酸的位点。

152、在某些实施方案中，所述第三经改造的aav的感染活性与第二经改造的aav的感染活性的比值不低于103。

153、在某些实施方案中，所述aav包含报告基因，例如荧光蛋白或荧光素酶，由此从报告基因产生与所述感染活性成比例的可检测信号。在某些实施方案中，所述报告基因可操作地连接至启动子，并且两侧有反向末端重复序列(itr)。

154、在某些实施方案中，在所述第二经改造的aav中，所述预设位点的残基被突变为含有四嗪基团的非天然氨基酸，所述封闭基团连接有tco基团（例如为tco-peg20k），从而经由tco基团与四嗪基团的iedda反应连接至非天然氨基酸。

155、在某些实施方案中，在所述第三经改造的aav中，所述预设位点的残基被突变为含有四嗪基团的非天然氨基酸，所述氨基基团连接有tco基团（例如为tco-nh2），从而经由tco基团与四嗪基团的iedda反应连接至非天然氨基酸。

156、突变的aars及组合物

157、在第六方面，本发明提供了一种突变的氨酰trna合成酶（aars），其包含seq idno: 1所示的序列。还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码所述突变的aars的核苷酸序列。还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。

158、在第七方面，本发明提供了一种组合物，其包含：

159、（a）第六方面所述的突变的aars或编码所述突变的aars的第一核酸分子；以及

160、（b）trna或编码所述trna的第二核酸分子，其中，所述trna包含seq id no:2所示的序列。

161、在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含所述第一核酸分子和第二核酸分子。

162、在某些实施方案中，所述载体为质粒或病毒载体。

163、在某些实施方案中，所述第一核酸分子任选地可操作地连接至第一调控元件，例如启动子，如组成型启动子，例如cmv、ef1α、cag、ubc启动子。

164、在某些实施方案中，所述第二核酸分子任选地可操作地连接至第二调控元件，例如启动子，例如rna聚合酶iii启动子，如u6启动子或h1启动子。

165、在某些实施方案中，所述组合物进一步包含编码靶蛋白的第三核酸分子，所述第三核酸分子包含被所述trna识别的终止密码子（例如tag或taa）。在某些实施方案中，所述靶蛋白含有非天然氨基酸，所述终止密码子对应于所述非天然氨基酸在靶蛋白中的位置。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸为含有四嗪基团的非天然氨基酸，例如mpet。

166、产生靶蛋白的方法

167、在第八方面，本发明提供了一种产生靶蛋白的方法，所述靶蛋白具有至少一个含有四嗪基团的非天然氨基酸残基，所述方法包括：

168、(a) 提供：(i)包含编码靶蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子，其中所述核苷酸序列在对应于所述非天然氨基酸的位置的密码子为终止密码子（例如tag或taa）；(ii)编码第六方面所述的突变的aars的第二核酸分子；(iii)编码trna的第三核酸分子，所述trna包含seq id no: 2所示的序列；

169、(b) 将所述第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子同时或以任意顺序依次引入（例如转化、转导或转染）至宿主细胞（例如hek-293t细胞）；

170、(c) 在含有非天然氨基酸的培养基中培养步骤(b)获得的宿主细胞，以允许将所述非天然氨基酸掺入到正在所述细胞中表达的靶蛋白中；其中，所述aars能够将非天然氨基酸装载到trna上，并随后将所述非天然氨基酸在对应于所述选择密码子的位置处掺入到所述蛋白中。

171、在某些实施方案中，所述非天然氨基酸为mpet。

172、在某些实施方案中，所述第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子存在于一种或多种载体上。在某些实施方案中，所述第一核酸分子、第二核酸分子以及第三核酸分子分别存在于不同的载体上。在某些实施方案中，所述第二核酸分子和第三核酸分子存在于相同的载体上，所述第一核酸分子存在于不同的载体上。

173、在某些实施方案中，所述一种或多种载体各自独立地选自质粒、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体及病毒。在某些实施方案中，所述一种或多种载体各自独立地选自质粒及病毒。在某些实施方案中，所述一种或多种载体各自独立地选自病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体为腺相关病毒、腺病毒、慢病毒或杆状病毒。

174、在某些实施方案中，将核酸引入细胞的方法是本领域技术人员熟知的，其中的任何一种均可以用于本发明，包括但不限于电穿孔、核转染、显微注射、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子聚合物转染、脂质体转染、或病毒感染。

175、在某些实施方案中，所述靶蛋白选自蛋白或多肽类药物（例如抗体或其抗体片段、疫苗、激素、凝血因子、生长因子或酶）、检测或诊断试剂、或工业用蛋白（例如工业酶）。

176、术语定义

177、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

178、当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。

179、关于蛋白/多肽的位置的术语“相应于”，诸如叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开的序列(诸如序列表中所示的)中的核苷酸或氨基酸位置，是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(诸如gap算法)与所公开的序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，相似序列(例如片段或物种变体)的对应残基可以通过结构比对方法与参考序列比对来确定。通过比对序列，本领域技术人员可以鉴定对应的残基，例如，使用保守的和同一的氨基酸残基作为指导。

180、在本文中，“相应于给定位置的氨基酸位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。因此，相应氨基酸位置可以通过序列比对（例如以获得最高百分数同一性时）目标aav衣壳蛋白序列与本文中所给出的示例性序列（如seq id no: 7-10）而鉴别。例如，表述“对应于seq id no: 8所示的aav-dj衣壳蛋白氨基酸序列的l585的位点”涵盖seq id no: 8所示的氨基酸序列中的第585位或者在另一aav衣壳蛋白氨基酸序列中的相应位置。

181、如本文中所使用的，术语“aav”包括所有类型的aav，包括野生型aav和重组或变体aav。aav变体包括但不限于具有突变或合成的衣壳的aav例如具有杂合衣壳的aav、假型aav以及自身互补的aav(scaav)。重组aav（raav）是将野生型aav的rep及cap基因全部由外源目的基因表达框替代，只保留了两端的itr序列。

182、如文本所示使用的，术语“可裂解连接子（cleavable linker）”是指对切割敏感的连接子，例如酶切割、酸诱导的切割、光诱导的切割和二硫化物键切割，也可称为可切割连接子。酶切割包括但不限于蛋白酶诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸酶诱导的切割和硫酸酯酶诱导的切割。

183、如文本所示使用的，术语“掩蔽部分”是指通过非天然氨基酸残基连接至aav衣壳蛋白的偶联部分，当aav衣壳蛋白与掩蔽部分结合时，可阻碍aav与其在靶细胞表面上的受体的结合。当掩蔽部分通过可裂解连接子连接至aav衣壳蛋白时，通过裂解所述连接子，可恢复aav与受体的结合。

184、如本文中所使用的，术语“抗体”是指能够特异性结合靶抗原的源自免疫球蛋白的分子。当提及术语“抗体”时，除非上下文明确指出，其不仅包括完整抗体，而且包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段。“完整抗体”典型地由两对多肽链（每对具有一条轻链(lc)和一条重链(hc)）组成。抗体轻链可分类为κ（kappa）和λ（lambda）轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为框架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循kabat, sequences of proteins of immunological interest (national institutesof health, bethesda, md. (1987 and 1991))，或chothia & lesk (1987) j. mol.biol. 196:901-917; chothia等人 (1989) nature 342:878-883的定义。

185、如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。抗原结合片段的非限制性实例包括fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、二硫键连接的fv、scfv、di-scfv、双抗体（diabody）、单域抗体（singledomain antibody）和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

186、如本文中所使用的，“抗体模拟物”意指具有与抗体相似的抗原结合活性的肽，但其并非衍生自抗体，而是衍生自非免疫球蛋白骨架蛋白，抗体模拟物由单链组成，这不同于其中两条重链和两条轻链形成异四聚体四级结构以发挥其功能的常规全长抗体。具体而言，这样的抗体模拟物包括衍生自蛋白a的z结构域的亲合体(affibody)(nygren,p.a.,febs j.275(11):2668-2676,2008)、衍生自泛素的γ-b晶体蛋白或affilin(ebersbach等人,j.mol.biol.372(1):172-185,2007)、衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的affimer(johnson等人,anal.chem.84(15):6553-6560,2012)、衍生自sac7d的affitin(krehenbrink等人,j.mol.biol.383(5):1058-1068,2008)、衍生自三螺旋卷曲螺旋蛋白的阿尔法体(alphabody)(desmet等人.、nat.commun.23(12):1556-1561,2005)、衍生自锚蛋白重复基序的darpin(stumpp等人、drug discov.today.13(15-16):695-701,2008)、衍生自fyn蛋白的sh3结构域的菲诺体(fynomer)(grabulovski等人,j.biol.chem.282(5):3196-3204,2007)、衍生自各种蛋白抑制剂的kunitz结构域的kunitz结构域肽(nixon和wood,curr.opin.drug discov.dev.9(2):261-268,2006)、衍生自纤连蛋白的第10个3型结构域的单体抗体(monobody)(koide和koide,methods mol.biol.352:95-109,2007)、衍生自碳水化合物结合模块32-2的nanoclamp(suderman等人,protein exp.purif.134:114-124,2017)、盲鳗来源的可变淋巴细胞受体(vlr)(boehm等人,ann.rev.immunol.30:203-220,2012)、和基于vlr的经工程化以增强抗原亲和力的repebody(lee等人,proc.natl.acad.sci.usa,109:3299-3304,2012)。

187、如本文中所使用的，在trna和氨酰基-trna合成酶的上下文中，术语“正交”是指对细胞或翻译系统而言，当与内源氨酰基-trna合成酶对内源trna的氨酰化相比时，正交trna(o-trna)被任何内源氨酰基-trna合成酶氨酰化的效率降低（例如，效率低于20%、低于10%、低于5%或低于1%）或甚至为零，或者与内源氨酰基-trna合成酶对内源trna的氨酰化相比，正交氨酰基-trna合成酶(o-rs)将任何内源trna氨酰化的效率降低（例如，效率低于20%、低于10%、低于5%或低于1%）或甚至为零。“正交对”由正交trna(o-trna)和正交氨酰基-trna合成酶(o-rs)组成。o-trna不会被内源合成酶酰化，并且能够介导将非天然氨基酸掺入由如下多核苷酸编码的蛋白质中，该多核苷酸包含在细胞中被o-trna识别的选择密码子；o-rs在细胞中识别o-trna并优先用非天然氨基酸氨酰化o-trna。术语“选择密码子”是指在翻译过程中被o-trna识别而未被内源trna识别的密码子。o-trna反密码子环识别mrna上的选择密码子，并且在多肽中的此位点处掺入其氨基酸，例如非天然氨基酸。在一些示例性实施方案中，选择密码子为终止密码子tag。

188、在某些实施方案中，本文所述正交氨酰trna合成酶识别四嗪非天然氨基酸（例如mptet），并用四嗪非天然氨基酸（例如mptet）酰胺化所述正交trna，所述正交trna的反密码子为终止密码子tag的反向互补物（即，cua）。由此，所述正交氨酰trna合成酶将非天然氨基酸装载到正交trna上，并随后将所述非天然氨基酸在对应于所述终止密码子的位置处掺入到所述蛋白中。

189、如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。可操作地连接到目的核酸序列的调节序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现目的核酸序列的表达。

190、如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

191、如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。

192、发明的有益效果

193、本发明首先提供了一种定点、均一的aav衣壳蛋白的化学修饰方法，基于此并结合蛋白质前药的设计理念对aav 病毒衣壳蛋白进行定点化学修饰，改造后的aav病毒通过掩蔽模块对aav活性进行封闭，并在特定组织实现aav活性的解封闭，进而实现了aav精准的组织靶向的基因递送，同时避免体内预存anti-aav中和抗体的识别，且有效降低aav诱导的免疫反应，实现aav二次注射，不仅具有广阔的应用前景，还具备临床转化的潜力。

194、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。