一种多酶定向酶解-低温超声制备高活性薏苡仁小分子肽的方法及应用与流程

本发明属于食品生物，具体涉及一种多酶定向酶解-低温超声制备高活性薏苡仁小分子肽的方法及应用。

背景技术：

1、薏苡仁为药食同源植物资源，富含蛋白质、淀粉、多糖、脂质及多酚类成分，长期用于食品、饮品和营养配方开发。随着功能食品产业的发展，植物源小分子肽因具有溶解性好、吸收利用率高、配伍适应性强等特点，逐渐成为薏苡仁深加工的重要方向。薏苡仁蛋白经适当酶解后可释放具有抗氧化、营养补充和机体调节潜力的肽段，但薏苡仁粉体系中同时含有淀粉、多糖和脂质伴生成分，蛋白质易被包埋或形成聚集结构，导致常规水提或简单酶解过程中底物暴露不足，酶解效率不稳定，小分子肽释放不充分，所得产物活性和批次一致性难以满足高品质食品原料的应用需求。

2、现有薏苡仁小分子肽制备方法多采用单酶酶解、常规热处理、普通离心或膜分离工艺，虽然能够获得一定量的薏苡仁肽产物，但仍存在酶切位点单一、肽段分布较宽、低分子活性肽比例偏低、热处理造成活性损失、分离纯化效率不足等问题。单独采用中性条件酶解时，部分疏水区或结构紧密区难以充分打开；单独采用碱性蛋白酶深度水解时，又容易出现局部过度水解、滋味劣变或活性肽段选择性不足的问题。常规超声或高温辅助处理虽可改善传质，但也可能加剧多酚氧化、肽段聚集或功能活性下降，因此需要建立温和、定向、可放大的协同酶解与低温辅助释放工艺。

3、此外，现有技术通常仅关注薏苡仁蛋白的酶解本身，较少从蛋白预分散、酶切位点暴露、活性肽保护和后续膜分离稳定性的整体角度进行设计。天然多酚和多糖衍生物具有良好的食品相容性，可通过氢键、疏水作用和弱络合作用改善蛋白分散状态，并有助于降低加工过程中的活性损失。若能将二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯引入薏苡仁蛋白预处理体系，再结合复合蛋白酶与碱性蛋白酶分段酶解、低温超声促释、纳滤富集、浓缩和干燥工艺，有望提高薏苡仁小分子肽的释放效率、活性保持率和产品稳定性，从而为其在食品领域中的应用提供更可靠的技术基础。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多酶定向酶解-低温超声制备高活性薏苡仁小分子肽的方法，包括以下步骤：

2、s1、以重量份计，将1.00份食品级薏苡仁粉加入6.00-8.00份纯化水中，搅拌，升温至90-100℃处理，得到薏苡仁预处理浆液；将薏苡仁预处理浆液冷却至45-55℃，加入0.003-0.012份二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯，搅拌，得到改性薏苡仁蛋白浆液；

3、s2、将改性薏苡仁蛋白浆液的调节至6.5-7.0，加入0.008-0.012份复合蛋白酶，在45-55℃下酶解，得到第一酶解液；将第一酶解液的调节至8.0-8.5，加入0.005-0.008份食品级碱性蛋白酶，在45-55℃下酶解，得到多酶定向酶解液；

4、s3、将多酶定向酶解液冷却至10-20℃，超声处理，得到超声酶解液；将超声酶解液升温至85-95℃灭酶，随后离心，得到薏苡仁肽粗液；

5、s4、将薏苡仁肽粗液进行纳滤处理，收集薏苡仁小分子肽的透过液；将薏苡仁小分子肽的透过液在50-60℃下浓缩，得到浓缩液；将浓缩液在50-60℃下干燥。

6、本发明中，多酶定向酶解低温超声制备高活性薏苡仁小分子肽的过程中，食品级薏苡仁粉与纯化水混合后受热，淀粉吸水膨胀并糊化，蛋白质从粉体组织中释放，形成薏苡仁预处理浆液。二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯加入后，其中菊粉链段与水相形成稳定分散体系，阿魏酸芳香酚结构和槲皮素多酚结构与薏苡仁蛋白表面的芳香氨基酸残基和极性基团之间形成氢键和疏水相互作用，使薏苡仁蛋白聚集状态松散，得到改性薏苡仁蛋白浆液。冷却后超声处理利用空化效应和剪切扰动破坏肽段与蛋白残片、淀粉残余物的缔合体，加速小分子肽从胶体体系释放，此阶段为物理促释而非新酶解反应。升温灭酶终止食品级中性蛋白酶、食品级木瓜蛋白酶和食品级碱性蛋白酶的作用，离心去除不溶物得到薏苡仁肽粗液，经纳滤分级使小分子肽进入透过液，再经浓缩和干燥获得高活性薏苡仁小分子肽。其中，在弱中性环境中，复合蛋白酶中的食品级中性蛋白酶优先在疏水性氨基酸羧基侧切断肽键，食品级木瓜蛋白酶则在碱性氨基酸羧基侧切断肽键，两者协同将大分子蛋白分解为较短肽段，得到第一酶解液。调至弱碱性环境后，食品级碱性蛋白酶作为丝氨酸内切蛋白酶继续切割较短肽段内部肽键，使肽段进一步缩短，形成多酶定向酶解液。

7、根据本发明的优选实施方式，步骤s1中，升温至90-100℃处理的时间为1-3h。

8、根据本发明的优选实施方式，步骤s2中，所述复合蛋白酶由食品级中性蛋白酶和食品级木瓜蛋白酶组成；所述食品级中性蛋白酶和食品级木瓜蛋白酶的质量比为1:1；在45-55℃下酶解1-2h，得到第一酶解液；在45-55℃下酶解1-3h，得到多酶定向酶解液。

9、根据本发明的优选实施方式，步骤s3中，超声处理的时间为10-20min，升温至85-95℃灭酶的时间为30-60min。

10、根据本发明的优选实施方式，所述二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯的制备步骤包括：

11、a2、将48-52份柠檬酸化菊粉中间体、14-16份食品级阿魏酸、280-320份食品级乙醇和28-32份4a分子筛加入反应器中，加入2.0-3.0份固定化脂肪酶，在45-50℃下反应，随后过滤，减压浓缩，沉淀，离心分离，得到阿魏酸菊粉接枝中间体；

12、a1、以重量份计，将95-105份食品级菊苣根提取物菊粉加入780-820份食品级乙醇水溶液中，在45-55℃下搅拌；加入11-13份食品级一水柠檬酸和1.5-2.5份食品级柠檬酸钠，调节至4.5-5.0，继续搅拌，随后减压浓缩，得到菊粉活化料；将菊粉活化料加热处理，冷却至室温，洗涤，干燥，得到柠檬酸化菊粉中间体；

13、a3、将28-32份阿魏酸菊粉接枝中间体加入480-520份食品级乙醇水溶液中，加入0.50-0.80份食品级二氢槲皮素和0.4-0.6份食品级柠檬酸钠，在30-40℃下搅拌；调节至4.5-5.0，加入0.05-0.15份食品级漆酶，反应，随后升温灭酶，冷却至室温，得到二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯粗液；

14、a4、将二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯粗液过滤，随后进行超滤，得到截留液；将截留液在40-50℃下浓缩，随后干燥。

15、本发明中，二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯的制备过程中，食品级菊苣根提取物菊粉先在食品级乙醇水溶液中充分溶胀和分散，菊粉链段上的果糖羟基和末端葡萄糖羟基暴露出来。食品级一水柠檬酸的羧基在弱酸性条件下被质子化，食品级柠檬酸钠与食品级一水柠檬酸形成缓冲对，调节体系酸碱度，使食品级菊苣根提取物菊粉链段保持稳定，并使食品级一水柠檬酸部分以单羧酸阴离子形式存在。减压浓缩后体系中乙醇和水分逐步减少，食品级菊苣根提取物菊粉与食品级一水柠檬酸在近无水态紧密接触，得到菊粉活化料。菊粉活化料经加热处理后发生脱水缩合，食品级一水柠檬酸的羧基与食品级菊苣根提取物菊粉链段上的羟基形成酯键，由于食品级一水柠檬酸含有多个羧基，部分羧基酯化后仍保留游离羧基和未完全酯化的羟基，使食品级菊苣根提取物菊粉转化为带有酯键、残留羧基和残余羟基的柠檬酸化菊粉中间体。柠檬酸化菊粉中间体进入食品级乙醇后，食品级阿魏酸在固定化脂肪酶活性中心的作用下发生酰基-酶中间体的形成，固定化脂肪酶随后将酰基转移到柠檬酸化菊粉中间体的羟基上，发生酯交换反应并释放乙醇，4a分子筛吸附反应副产物，使反应平衡持续向接枝方向推进，最终生成带有阿魏酸芳香酚结构的阿魏酸菊粉接枝中间体。阿魏酸菊粉接枝中间体再进入食品级乙醇水溶液中，食品级二氢槲皮素借助乙醇助溶分散到反应体系中，食品级柠檬酸钠维持体系弱酸性以匹配食品级漆酶的最适酸碱环境，食品级漆酶活性中心的铜离子簇接受底物电子并将氧分子还原为水，使阿魏酸残基和食品级二氢槲皮素的酚羟基各自失去一个电子和一个质子，分别形成苯氧自由基中间体。苯氧自由基中间体彼此之间发生交叉偶联和部分自偶联反应，使食品级二氢槲皮素结构通过新形成的碳碳键或碳氧碳键连接到含阿魏酸残基的菊粉链段上，得到二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯粗液，再经过滤、超滤、浓缩和干燥得到二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯。该接枝酯同时含有菊粉亲水链段、柠檬酸酯化连接结构、阿魏酸芳香酚结构和槲皮素多酚结构。

16、根据本发明的优选实施方式，步骤a1中，所述乙醇水溶液的体积分数为30-50%；加热处理的温度为105-115℃，加热处理的时间为45-70min。

17、根据本发明的优选实施方式，步骤a2中，在45-50℃下反应的时间为10-14h。

18、根据本发明的优选实施方式，步骤a3中，所述食品级乙醇水溶液的体积分数为40-50%；反应的温度为30-35℃，反应的时间为6-8h，升温灭酶的温度为70-80℃，升温灭酶的时间为10-20min。

19、根据本发明的优选实施方式，步骤a4中，干燥的温度为40-50℃。

20、本发明还提供一种所述的多酶定向酶解-低温超声制备高活性薏苡仁小分子肽的方法制得的高活性薏苡仁小分子肽在制备食品中的应用。

21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

22、（1）本发明以食品级薏苡仁粉和纯化水形成薏苡仁预处理浆液，经热处理后使食品级薏苡仁粉中的淀粉吸水糊化，蛋白质从粉体结构中释放出来。随后加入二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯并搅拌，可改善蛋白质在水相中的分散状态，减少蛋白聚集对后续酶解的影响，使改性薏苡仁蛋白浆液中的蛋白质更容易与复合蛋白酶和食品级碱性蛋白酶接触，从而提高薏苡仁小分子肽的释放程度。

23、（2）本发明采用复合蛋白酶和食品级碱性蛋白酶分段处理改性薏苡仁蛋白浆液，复合蛋白酶由食品级中性蛋白酶和食品级木瓜蛋白酶组成，可先对薏苡仁蛋白中不同易水解部位进行切割，形成第一酶解液；再通过食品级碱性蛋白酶继续水解较短肽段中的肽键，形成多酶定向酶解液。该处理方式能够减少单一酶解造成的底物水解不足，使所得肽段更集中地向薏苡仁小分子肽方向转化。

24、（3）本发明所述二氢槲皮素阿魏酸菊粉接枝酯由食品级菊苣根提取物菊粉、食品级乙醇水溶液、食品级一水柠檬酸、食品级柠檬酸钠、食品级阿魏酸、食品级乙醇、4a分子筛、固定化脂肪酶、食品级二氢槲皮素、食品级柠檬酸钠和食品级漆酶制备，能够与薏苡仁蛋白形成稳定接触。多酶定向酶解液经超声处理后，可削弱小分子肽与蛋白残片、淀粉残余物及多糖之间的缔合；再经灭酶、离心、纳滤、浓缩和干燥，可去除不溶杂质和大分子组分，得到适用于制备食品的高活性薏苡仁小分子肽。