一种利用非肽类Linker连接的融合多肽、制备方法及应用与流程

本发明属于生物制药，具体涉及一种利用peg连接的融合多肽、制备方法及应用。

背景技术：

1、融合多肽是通过将两个或多个功能多肽通过linker连接而成的复合分子，广泛应用于药物开发、诊断和治疗领域。例如，在靶向治疗中，融合多肽可以通过一个多肽(如靶向多肽)特异性识别靶细胞，而另一个多肽(如效应多肽)发挥治疗作用。这种设计能够显著提高药物的靶向性和治疗效果，同时减少对正常细胞的毒副作用。然而，融合多肽的设计和优化面临诸多挑战，其中linker的选择是关键因素之一。

2、linker不仅影响多肽的稳定性、溶解性和功能协同性，还决定了其在体内的半衰期和免疫原性。传统的融合多肽设计通常依赖于氨基酸linker(如(gly-ser)n)，这些linker在实际应用中存在以下显著问题：稳定性不足、免疫原性较高、空间位阻效应、溶解性较差。为了解决这些问题，研究人员开始探索非肽类linker的应用，其中聚乙二醇(peg)因其独特的理化性质成为研究热点。peg linker具有高水溶性、延长半衰期、降低免疫原性和柔性适中等优势，能够显著提高融合多肽的稳定性、溶解性和功能协同性。peg linker可以通过多种化学方法与多肽连接，如nhs酯反应、马来酰亚胺反应和点击化学反应，常见的peg链长度包括短链peg(如peg2、peg4)、中链peg(如peg8、peg12)和长链peg(如peg24)，不同长度的peg链对融合多肽的功能具有重要影响。同时，分支型peg修饰技术，可以实现多肽分子多价连接，优化多肽比例控制，更好的发挥融合分子的功效。peg linker在融合多肽设计中的应用实例包括药物递送、靶向治疗和生物传感器等，例如使用peg linker连接靶向多肽和药物分子，提高药物的靶向性和治疗效果。

3、但是，氨基酸linker作为最早期生物医药界使用的技术，存在部分缺陷。例如，稳定性不足：氨基酸linker在体内易被蛋白酶降解，导致融合多肽的半衰期较短，可能会限制了融合多肽在长效治疗中的应用；免疫原性较高：氨基酸linker可能暴露抗原表位，引发免疫反应，极有可能导致融合多肽被免疫系统清除，降低其治疗效果；合成成本高：氨基酸linker化学成分本质上与小分子有机物不同，导致融合多肽合成成本较高。空间位阻效应：氨基酸linker的长度和柔性有限，可能导致多肽a和多肽b之间的空间位阻，影响多肽a和多肽b的功能协同性；溶解性较差：某些氨基酸linker的疏水性较强，导致融合多肽在水相环境中容易聚集或沉淀，这种情况下融合多肽的生物利用度会受到影响。

4、通过改用peg连接方式，本发明旨在提供一种稳定性高、免疫原性低、功能协同性好的融合多肽，为其在药物开发、靶向治疗和生物传感器等领域的应用提供新的解决方案。

技术实现思路

1、针对上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于一种基于peg linker的融合多肽，以解决传统氨基酸linker存在的稳定性差、合成成本高、功能受限等问题，同时提高融合多肽的溶解性、半衰期和功能协同性。通过peg linker融合多肽与氨基酸linker融合多肽的多项实验测试对比，peg linker融合多肽在多项参数值中均有优势。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种利用peg连接的融合多肽，所述融合多肽为通过非肽类linker连接多肽a和多肽b形成的；

4、所述融合多肽的结构通式为：多肽a-(非肽类linker)n-多肽b或多肽b-(非肽类linker)n-多肽a；

5、其中，多肽a为o肽、o肽衍生肽或o肽衍生物；多肽b为g肽、g肽衍生肽或g肽衍生物；

6、o肽为核酸序列seq id no.1-8中的任意一条或多条的组合序列；

7、g肽为核酸序列seq id no.9-17中的任意一条或多条的组合序列；

8、n表示多聚体的聚合个数，n为整数。

9、所述的一种利用peg连接的融合多肽，所述非肽类linker为peg linker、烷基链linker、点击化学linker或多糖linker；其中，烷基链linker(如c6、c12)适合疏水环境，提高融合多肽的稳定性。点击化学linker(如dbco-叠氮、tco-四嗪)适合高效连接，减少反应条件限制。多糖linker(如透明质酸、壳聚糖)适合生物相容性要求高的场景。

10、优选，所述peg linker为线性peg或分支型peg；(本发明具体实施方式中是以线性peg为例进行的实验，分支型peg同样可取的类似的效果。)

11、更优选，所述分支型peg为四臂聚乙二醇(4-arm peg)或八臂聚乙二醇(8-armpeg)；使用分支型peg(如4-arm peg、8-arm peg)连接多肽a和多肽b，实现多价连接，优化多肽比例控制。其中，4-arm peg可以连接3分子多肽a和1分子多肽b，优化多肽比例控制。8-arm peg可以连接4分子多肽a和4分子多肽b，适用于多价配体连接。

12、优选，所述peg linker中peg的个数为2～24。使用不同长度的peg linker(如peg2、peg4、peg8、peg12、peg24等)连接多肽a和多肽b。短链peg(如peg2、peg4)适合需要较短linker的场景，减少空间位阻。长链peg(如peg12、peg24)适合需要较大空间自由度的场景，减少多肽a和多肽b之间的相互作用。

13、所述的一种利用peg连接的融合多肽，所述o肽衍生肽为包含o肽的多肽，或与o肽序列同源性高于50％、80％、90％、95％或99％的序列；

14、所述o肽衍生物为o肽或o肽衍生肽经过末端或侧链的常规修饰后所得产物，或连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物，或经过同位素标记修饰得到的产物；

15、所述g肽衍生肽为包含g肽的多肽，或与g肽序列同源性高于50％、80％、90％、95％或99％的序列；

16、所述g肽衍生物为g肽或g肽衍生肽经过末端或侧链的常规修饰后所得产物，或连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物，或经过同位素标记修饰得到的产物。

17、所述常规修饰为荧光基团修饰、磷酸化修饰、二硫键的环化修饰、生物素标记修饰、光敏剂、叠氮修饰、peg修饰、甲基化修饰、荧光淬灭基团修饰、蛋白偶联修饰、小分子化合物修饰、氨基化修饰、酰胺化修饰、羟基化修饰、羧基化修饰、羰基化修饰、烷基化修饰、乙酰化修饰、硝基化修饰、酯化修饰或糖基化修饰；

18、优选地，所述荧光基团修饰中所用的荧光染料选自amca、fitc、rhodamine、cy3、cy5、cy5.5、cy7、aie或icg，该修饰可用于荧光检测；

19、优选地，所述磷酸化修饰选自p-ser、p-thr、p-tyr中的一种或多种的组合；

20、优选地，所述生物素标记修饰中生物素选自d-生物素、生物素酰肼、光敏生物素或生物素-dutp；

21、优选地，所述氨基化修饰为多肽n端乙酰化修饰；

22、优选地，所述羧基化修饰为多肽c端的酰胺化修饰；

23、优选地，所述硝基化修饰为tyr修饰；

24、优选地，所述糖基化修饰选自ser、asn、thr、tyr中的一种或多种的组合；

25、优选地，所述侧链的常规修饰为多肽中氨基酸侧链r基上的修饰；

26、所述标签为his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc或profinityexact；

27、所述同位素标记修饰中所用的同位素选自13c、14c、14n、15n、2h、3h、18o、32p、32s、34s、35s、36s、35cl、37cl、125i或131i中的一种或多种的组合。

28、所述的一种利用peg连接的融合多肽，所述非肽类linker连接多肽a和多肽b的方式为nhs酯法、马来酰亚胺法、点击化学法。确保多肽a和多肽b的结构和功能在连接过程中不受影响。其中，nhs酯反应适合与多肽的氨基连接，形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺反应适合与多肽的巯基连接，形成稳定的硫醚键。点击化学反应适合高效连接，减少反应条件限制。

29、第二方面，本发明提供了任一项所述的一种利用peg连接的融合多肽的制备方法，包括以下步骤：

30、利用固相合成或液相合成的方法合成多肽a和多肽b，可选地对多肽a和多肽b进行活化，按顺序通过非肽类linker将活化后多肽a和多肽b进行连接，获得融合多肽。

31、第三方面，本发明提供了一种核酸，其编码任一项所述的融合多肽。

32、第四方面，本发明提供了一种载体，包含所述的核酸。

33、第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，转染了所述的载体。

34、第六方面，本发明提供了任一项所述的融合多肽在制备治疗和/或预防脱发、痤疮或皮炎的药物、医美用品或化妆品中的应用。

35、所述的应用，所述融合多肽降低雄激素引起的人毛囊乳头细胞凋亡水平，维持支持细胞生长水平，恢复雄激素引起的人皮脂腺细胞中g0/g1细胞占比，抑制该细胞增值。

36、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

37、1、本发明利用peg链的高水溶性，显著提高融合多肽的溶解性。在药物制剂中，peg化融合多肽的聚集和沉淀现象显著减少。解决了现有技术中氨基酸linker的疏水性较强，导致融合多肽在水相环境中容易聚集或沉淀的问题。

38、2、本发明使用peg linker替代氨基酸linker，减少多余氨基酸存在引入的问题，减少氨基酸的合成成本。通过实验验证，peg化融合多肽在体外环境中，存留时间延长。在动物模型中，peg化融合多肽的体内半衰期同样被延长。解决了现有技术中氨基酸linker在体内易被蛋白酶降解，导致融合多肽的半衰期较短；体外环境中，肽键在酸性、碱性或高温条件下容易发生水解反应，导致氨基酸组成不稳定的问题。

39、3、本发明通过选择合适长度的peg linker，为多肽a和多肽b提供足够的空间自由度。通过细胞功能实验验证，peg化融合多肽的治疗效果显著优于传统氨基酸linker融合多肽。解决了现有技术中氨基酸linker的长度和柔性有限，可能导致多肽a和多肽b之间的空间位阻的问题。