一种苯并咪唑类驱虫药半抗原、杂交瘤细胞株及其应用

本发明涉及安全免疫检测，尤其是指一种苯并咪唑类驱虫药半抗原、杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

1、苯并咪唑类驱虫药是广谱驱虫药，有完全杀死钩虫卵和鞭虫卵以及部分杀死蛔虫卵的作用，对虫体的β-微管蛋白有很强的亲和力，在很低浓度下就能与之结合，可通过影响虫体糖类的代谢和相关能量的生成抑制其微管的聚合，引起虫体表皮或肠细胞的消失，可选择性与不可逆性地抑制虫体从肠道内摄取葡萄糖和其他营养成份，最后导致虫体死亡。适用于治疗人体和动物体因鞭虫、蛲虫、钩虫、绦虫、粪类圆线虫、蛔虫等单种或多种蠕虫引起的感染。

2、目前，苯并咪唑类驱虫药检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简便的检测甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药残留物的方法。

3、酶联免疫吸附试验（elisa）是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测苯并咪唑类驱虫药的前提是得到对苯并咪唑类驱虫药具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对苯并咪唑类驱虫药具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体，但在制备能分泌苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备苯并咪唑类驱虫药半抗原和完全抗原和如何使小鼠产生强免疫效应，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种苯并咪唑类驱虫药半抗原、杂交瘤细胞株及其应用。本发明制备的苯并咪唑类驱虫药半抗原通过合成人工抗原，免疫小鼠得到杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2026年04月24日，保藏编号为cgmcc no. 46830。此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药具有较好的检测灵敏度，具有广谱性，可以用于建立甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药的免疫学检测方法，检测食品中甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药的残留。

2、本发明通过以下技术方案得到：

3、本发明第一个目的是提供一种苯并咪唑类驱虫药半抗原，所述苯并咪唑类驱虫药半抗原的结构式为：

4、。

5、本发明第二个目的是提供所述的苯并咪唑类驱虫药半抗原的制备方法，包括以下步骤：将甲苯达唑与羧甲基羟胺半盐酸盐（cmo）在有机溶剂中加热反应，去除溶剂后萃取，得到所述苯并咪唑类驱虫药半抗原。

6、本发明第三个目的是提供一种苯并咪唑类驱虫药人工抗原，由所述的苯并咪唑类驱虫药半抗原与载体蛋白偶联得到。

7、在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白选自钥孔血蓝蛋白和/或鸡卵白蛋白。

8、本发明第四个目的是提供一株分泌苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由所述苯并咪唑类驱虫药半抗原通过合成人工抗原，免疫小鼠得到；所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2026年04月24日，保藏编号为cgmcc no. 46830。

9、本发明第五个目的是提供一种苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

10、本发明第六个目的是提供一种检测产品，所述检测产品中含有所述的苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体。

11、在本发明的一个实施例中，所述检测产品还包括包被原。

12、在本发明的一个实施例中，所述检测产品包括试纸条、试剂盒或芯片。

13、本发明第七个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体、所述的检测产品在检测苯并咪唑类驱虫药中的应用；所述应用不涉及疾病的诊断与治疗；

14、所述苯并咪唑类驱虫药包括甲苯达唑、氟苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑砜、芬苯达唑、奥苯达唑、阿苯达唑、阿苯达唑砜和帕苯达唑中的一种或多种。

15、本发明提供了上述一种分泌苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

16、步骤1：制备苯并咪唑类驱虫药半抗原及苯并咪唑类驱虫药完全抗原，将获得的苯并咪唑类驱虫药完全抗原与弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化，制备成免疫原；

17、步骤2：将得到的免疫原通过背部皮下注射，注射进入balb/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；

18、步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接elisa检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药抗体灵敏度高的小鼠；

19、步骤4：将筛选出的小鼠通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药完全抗原；

20、步骤5：将冲刺免疫后的balb/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，融合后的细胞通过hat培养基筛选培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌高灵敏度苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

21、在本发明的一个实施例中，步骤1中，所述苯并咪唑类驱虫药半抗原的结构式如下：

22、。

23、在本发明的一个实施例中，所述苯并咪唑类驱虫药半抗原的合成路径如下：

24、。

25、在本发明的一个实施例中，步骤1中，所述苯并咪唑类驱虫药完全抗原的结构式如下：

26、。

27、在本发明的一个实施例中，所述苯并咪唑类驱虫药完全抗原的制备方法，包括以下步骤：将甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶解于无水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，搅拌反应，得到活化的甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药半抗原溶液，即a液；将钥孔血蓝蛋白用碳酸盐缓冲溶液（cbs）稀释，得到b液；将a液缓慢加入到b液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液（pbs）透析反应液，得到完全抗原。

28、在本发明的一个实施例中，所述苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的制备方法为：取balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为cgmcc no.46830的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，得到单克隆抗体，低温保存。

29、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下有益效果：

30、（1）本发明获得的苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体，对甲苯达唑及多种苯并咪唑类驱虫药有较好的检测灵敏度（对甲苯达唑ic50值为0.03 ng/ml）；

31、（2）本发明获得的分泌苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的杂交瘤细胞株可以用于免疫分析检测。

32、生物材料保藏

33、一株分泌苯并咪唑类驱虫药单克隆抗体的杂交瘤细胞fnt，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2026年04月24日，保藏编号为cgmcc no.46830。