一种VP1单克隆抗体和多克隆抗体及其基于乳胶微球免疫层析在检测猫杯状病毒中的应用的制作方法

本发明涉及猫杯状病毒，尤其是指一种vp1单克隆抗体和多克隆抗体及其基于乳胶微球免疫层析在检测猫杯状病毒中的应用。

背景技术：

1、猫杯状病毒（feline calicivirus, fcv）属于杯状病毒科（caliciviridae）、水疱病毒属（vesivirus），是一种无囊膜的单股正链rna病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径约30-40 nm，表面具有32个杯状凹陷，容易发生遗传突变和抗原变异。fcv的基因组全长约7.7 kb，基因组中包含三个主要的开放阅读框（open reading frame, orfs），其中orf2编码的衣壳蛋白vp1是病毒的主要结构蛋白，在病毒的复制、感染以及诱导中和抗体等方面都发挥着重要作用。该蛋白结构主要由a、b、c、d、e、f六个区域构成，vp1基因组的a、b、d和f区相对保守，而c区和e区属于高变区，因此不同毒株之间存在显著的抗原差异，这对疫苗研发构成了极大的挑战[3]。vp1及其截短体重组蛋白的研究为疫苗开发提供了基础。

2、fcv已经成为危害全球猫科动物健康的主要传染性病原。在fcv感染的初期，临床多表现为上呼吸道症状，如打喷嚏、流鼻涕、结膜炎和精神沉郁。随后将出现fcv感染最典型的症状，即口腔溃疡（常见于舌、硬腭），导致流涎、厌食和咀嚼困难。某些强毒株会进一步引发严重的全身性反应，引发广泛的血管内皮细胞损伤以及严重的坏死性血管炎，同时导致血管通透性增加、组织水肿、间质性肺炎以及肝、胰等多器官的出血坏死，因弥漫性血管内凝血和多系统器官衰竭而死亡。不同fcv毒株之间毒力差异大，我国已经发现的部分高致病性毒株如fcv-vsd，可引发严重全身性临床症状。强毒株引发的高发病率和高死亡率对幼猫群体的健康构成了严重威胁。并且，猫杯状病毒的高变异率对其检测环节构成了直接挑战。

3、目前，对猫杯状病毒的实验室诊断仍高度依赖pcr等分子生物学技术，但该病毒基因组的快速演变，尤其是编码衣壳蛋白的高变区，常导致用于pcr检测的引物结合位点发生突变，从而显著降低检测灵敏度。并且这些检测方法检测周期长、设备要求高、专业操作复杂，难以在基层宠物医院、动物收容所或疫情现场进行快速推广。关于猫杯状病毒的免疫层析检测方法较少，国内外常常使用胶体金、荧光微球等作为信号标记物，进行免疫层析试纸条检测。

技术实现思路

1、为解决以上技术问题，本发明提供了一种基于乳胶微球的免疫层析试纸条快速检测方法，以实现对猫杯状病毒（feline calicivirus, fcv）抗原的简便、快速、可视化检测，本发明通过原核表达系统表达vp1蛋白并制备相应的多克隆抗体及单克隆抗体。本发明基于乳胶微球的免疫层析检测方法在保持较高准确性的同时，显著提升了检测的便捷性与推广适用性，为实现早期诊断、及时干预和有效控制病毒传播提供了有力的技术支撑，对提升基层猫杯状病毒的防控能力具有重要的实践意义。

2、本发明的第一个目的在于提供一种vp1抗原，所述vp1抗原的氨基酸序列如seq idno 1所示。

3、本发明的第二个目的在于提供一种抗所述vp1抗原的多克隆抗体pab-vp1和单克隆抗体2b9。

4、本发明的第三个目的在于提供一种试纸条，包括所述的多克隆抗体pab-vp1和单克隆抗体2b9。

5、在本发明的一些实施例中，所述多克隆抗体pab-vp1偶联红色乳胶微球作为免疫探针，单克隆抗体2b9作为检测线抗体；

6、在本发明的一些实施例中，所述多克隆抗体pab-vp1偶联红色乳胶微球通过以下方法制备得到：

7、提供一种含有偶联缓冲液的乳胶微球悬浮液；

8、向所述乳胶微球悬浮液中加入edc溶液和nhs溶液，超声混匀，随后旋转活化；活化完成后，固液分离取固相并用偶联缓冲液洗涤；加入偶联缓冲液，超声混匀微球，得到微球溶液；

9、将多克隆抗体pab-vp1分散于偶联缓冲液中，得到含抗体的偶联液；

10、将含抗体的偶联液与所述微球溶液混匀并旋转偶联；待反应完成，固液分离取固相并清洗，得到多克隆抗体pab-vp1偶联红色乳胶微球。

11、在本发明的一些实施例中，所述含抗体的偶联液的浓度为0.1-0.4μg/μl，优选0.2μg/μl。

12、在本发明的一些实施例中，旋转活化的条件：37℃、180 r/min条件下旋转活化45min；旋转偶联的条件：37℃、180 r/min条件下旋转偶联2 h。

13、本发明的第四个目的在于提供一种试剂盒，包括所述的多克隆抗体和/或单克隆抗体、或所述试纸条。

14、在本发明的一些实施例中，所述双抗体夹心elisa法试剂盒。

15、本发明的第五个目的在于提供所述的多克隆抗体或单克隆抗体、所述试纸条或所述试剂盒在制备检测猫杯状病毒中的应用。

16、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

17、本发明基于双抗体夹心原理，以多克隆抗体pab-vp1偶联红色乳胶微球作为免疫探针，单克隆抗体2b9作为检测线抗体。对工艺参数优化后的试纸条进行性能验证，结果显示，该试纸条对纯化vp1蛋白的检测灵敏度为22.66 ng/ml；与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒及正常细胞裂解液均无交叉反应，特异性良好；批内与批间重复性稳定；加速破坏实验显示其在37℃下可稳定保存25天以上。使用该试纸条与rt-pcr方法平行检测96份临床拭子样本，两者总符合率为90.6% (87/96)，其中阳性符合率为85.3% (29/34)，阴性符合率为93.5% (58/62)。结果表明，本发明构建的猫杯状病毒乳胶微球免疫层析检测试纸具有操作简便、反应快速、强特异性、良好稳定性的特点，可用于猫杯状病毒感染的早期诊断，对猫杯状病毒的快速筛查具有重要意义。

1.一种vp1抗原，其特征在于，所述vp1抗原的氨基酸序列如seq id no 1所示。

2.一种抗权利要求1所述vp1抗原的多克隆抗体pab-vp1和单克隆抗体2b9。

3.一种试纸条，其特征在于，包括权利要求2所述的多克隆抗体pab-vp1和单克隆抗体2b9。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述多克隆抗体pab-vp1偶联红色乳胶微球作为免疫探针，单克隆抗体2b9作为检测线抗体。

5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述多克隆抗体pab-vp1偶联红色乳胶微球通过以下方法制备得到：

6.根据权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述含抗体的偶联液的浓度为0.1-0.4μg/μl。

7.根据权利要求5所述的试纸条，其特征在于，旋转活化的条件：37℃、180 r/min条件下旋转活化45 min；旋转偶联的条件：37℃、180 r/min条件下旋转偶联2 h。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的多克隆抗体和/或单克隆抗体、或权利要求3~7中任一项所述试纸条。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述双抗体夹心elisa法试剂盒。

10.一种如权利要求2所述的多克隆抗体或单克隆抗体、权利要求3~7中任一项所述试纸条或权利要求8或9所述试剂盒在制备检测猫杯状病毒中的应用。