靶向HHATmRNA的小干扰RNA及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种靶向hhat mrna的小干扰rna及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

背景技术：

1、骨关节炎（oa）是临床常见慢性退行性关节疾病，主要表现为关节软骨退变、细胞外基质降解与软骨细胞死亡，是中老年关节疼痛及功能障碍的重要诱因。当前临床治疗手段包括镇痛抗炎、关节腔注射透明质酸或糖皮质激素、康复训练以及终末期关节置换等，大多仅能够缓解临床症状，尚缺乏可明确改变疾病进程的治疗药物。软骨细胞死亡、脂质过氧化、铁稳态紊乱及细胞外基质降解，是推动骨关节炎进展的关键病理环节。

2、铁死亡是铁依赖性脂质过氧化介导的程序性细胞死亡，现已证实其与软骨退变密切相关。脂肪酸结合蛋白fabp4参与脂质代谢调控，是骨关节炎潜在靶点。发明人经软骨细胞铁死亡模型研究发现，细胞外与细胞内fabp4功能截然相反：外源性fabp4可抑制软骨细胞铁死亡，细胞内过表达fabp4则促进铁死亡；该差异不取决于蛋白总量，而和蛋白来源、棕榈酰化修饰及细胞器定位相关。

3、棕榈酰化作为重要蛋白脂质修饰，可调控蛋白膜结合、亚细胞定位、蛋白互作及稳定性。研究表明外源性fabp4进入软骨细胞后会发生s-棕榈酰化与n-棕榈酰化；s-棕榈酰化帮助其逃逸内吞体并定位于内质网，组装形成抗铁死亡的 fabp4-cd36-scd1脂质代谢模块；n-棕榈酰化发生较晚，介导 fabp4 向脂滴再分布，改变蛋白功能。

4、现有技术仍存在诸多缺陷：其一，现有骨关节炎药物以对症治疗为主，缺少针对软骨细胞铁死亡、脂质代谢紊乱的病程干预手段。其二，2-溴棕榈酸等广谱棕榈酰化抑制剂无靶点特异性，易产生脱靶效应，用药安全性不足。其三，现有fabp4用于骨关节炎的研究多采取整体抑制策略，未区分胞外、胞内fabp4的功能差异，也未提出通过调控fabp4的n-棕榈酰化来治疗骨关节炎。其四，hedgehog酰基转移酶抑制剂现有研究局限于hedgehog通路。

5、因此，本领域亟需开发靶向调控fabp4棕榈酰化修饰、干预软骨细胞铁死亡，进而阻滞骨关节炎进展的新干预策略。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明公开了一种刺猬酰基转移酶（hedgehogacyltransferase，简称hhat）的小干扰rna及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，该hhat的小干扰rna能够降低hhat mrna和/或蛋白表达，减少fabp4的n-棕榈酰化水平，从而调节fabp4介导的脂质代谢、脂质过氧化和软骨细胞存活。

2、对此，本发明采用的技术方案为：

3、一种靶向hhat mrna的小干扰rna（sirna），包含正义链和反义链，所述正义链和反义链靶向hhat基因转录本，抑制hhat基因的表达。进一步地，所述靶向hhat mrna的小干扰rna包括未修饰sirna、化学修饰sirna、双链rna、短发夹rna（shrna）或人工微小rna（microrna）。

4、此技术方案通过rna干扰技术特异性沉默hhat基因表达，阻断hedgehog信号通路的过度激活，降低脂肪酸结合蛋白4的n-棕榈酰化水平，调控外源性或内源性fabp4在软骨细胞中的细胞器定位和铁死亡易感性，从而抑制软骨降解、延缓骨关节炎进展。

5、所述sirna作用于hhat mrna编码区或非编码区，能够使hhat mrna或蛋白表达水平降低至少30%，优选降低至少50%，更优选降低至少70%；并降低fabp4的n-棕榈酰化水平。

6、作为本发明的进一步改进，所述靶向hhat mrna的小干扰rna靶向人hhat基因转录本，其靶序列如seq id no:1所示：5′-aagtatagaccctggatta-3′。

7、作为本发明的进一步改进，所述靶向hhat mrna的小干扰rna的正义链序列如seqid no:2所示：5′-gcaaguauagacccuggaatt-3′；反义链序列如seq id no:3所示：5′-uuccagggucuauacuugctt-3′。

8、作为本发明的进一步改进，所述短发夹rna的序列如seq id no:4所示：5′-gatccggcaaguauagacccuggaauucaagagauuccagggucuauacuugcttttttttgaatt-3′。

9、作为本发明的进一步改进，所述靶向hhat mrna的小干扰rna的正义链和/或反义链的核糖2′位具有2′-o-甲基和/或2′-氟修饰，和/或其末端具有硫代磷酸酯修饰，和/或其3′端具有dtdt悬垂结构。

10、作为本发明的进一步改进，所述小干扰rna靶向非人哺乳动物hhat同源mrna，所述非人哺乳动物包括大鼠，其相应的mrna靶序列如seq id no:5所示。

11、本发明公开了一种核酸表达载体，所述核酸表达载体编码如上所述的靶向hhatmrna的小干扰rna。

12、作为本发明的进一步改进，所述核酸表达载体为质粒、腺相关病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。优选地，所述核酸表达载体为腺相关病毒载体。

13、本发明公开了一种药物组合物，包含如上所述的靶向hhat mrna的小干扰rna或如上所述的核酸表达载体，以及药学上可接受的载体。所述药物组合物用于抑制软骨细胞铁死亡、降低脂质过氧化、降低fe2+积累、降低mda或调节acsl4、slc7a11、col2a1、mmp13表达。

14、作为本发明的进一步改进，所述药学上可接受的载体选自脂质纳米颗粒、阳离子脂质体、聚合物纳米颗粒、透明质酸衍生物水凝胶、甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶、外泌体、胶束或缓释微球。

15、作为本发明的进一步改进，所述药学上可接受的载体选自脂质纳米颗粒、阳离子脂质体、聚合物纳米颗粒、透明质酸衍生物水凝胶、甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶、外泌体、胶束或缓释微球。

16、作为本发明的进一步改进，所述的药物组合物还包含选自外源性fabp4-his、fabp4-c2a、fabp4-c2s、fabp4-wt、铁死亡抑制剂、透明质酸、抗炎药物或软骨保护剂中的一种或多种联合成分。

17、作为本发明的进一步改进，所述药物组合物为关节腔局部给药制剂。

18、作为本发明的进一步改进，所述关节腔局部给药制剂适用于膝关节、髋关节、踝关节、肩关节、肘关节或腕关节的给药。

19、作为本发明的进一步改进，所述关节腔局部给药制剂为注射剂、组织贴敷剂或与水凝胶支架联合的植入剂。

20、作为本发明的进一步改进，对于小动物实验，hhat-sirna可按0.1-50 μg/关节、优选1-20 μg/关节给药；对于编码shrna的病毒载体，可按109-1012 vg/关节给药；对于人体或大型动物，可根据关节体积和递送系统调整剂量。给药频率可为每周一次、每两周一次或每月一次，也可根据缓释系统调整。

21、本发明公开了如上所述的靶向hhat mrna的小干扰rna的应用，用于制备治疗骨关节炎的药物中。进一步地，所述药物通过关节腔局部给药。所述药物用于抑制软骨细胞铁死亡、降低脂质过氧化、降低fe2+积累、降低mda或调节acsl4、slc7a11、col2a1、mmp13表达。

22、作为本发明的进一步改进，所述的靶向hhat mrna的小干扰rna与fabp4-c2a、fabp4-c2s或其他保留cys118 s-棕榈酰化能力的fabp4变体联合使用。

23、本发明公开了如上所述的核酸表达载体的应用，用于制备治疗骨关节炎的药物中。

24、进一步地，对于小动物实验，hhat-sirna可按0.1-50μg/关节、优选1-20μg/关节给药；对于编码shrna的病毒载体，可按109~1012 vg/关节给药；对于人体或大型动物，可根据关节体积和递送系统调整剂量。给药频率可为每周一次、每两周一次或每月一次，也可根据缓释系统调整。

25、现有技术相比，本发明的有益效果为：

26、第一，本发明的技术方案首次以hhat为靶点，通过rna干扰技术治疗骨关节炎，区别于传统镇痛抗炎对症治疗，提供新型治疗策略，从hedgehog信号通路源头阻断软骨退变进程，属于疾病修饰型治疗。

27、第二，特异性高、毒副作用低。本发明的技术方案采用sirna特异性靶向hhatmrna，避免广谱棕榈酰化抑制剂（如2-溴棕榈酸酯）非特异性干扰所有棕榈酰化事件的毒副作用，安全性显著提高。而且本发明首次将hhat调控的fabp4 n-棕榈酰化/细胞器定位与软骨细胞铁死亡相关联，基于该机制提出hhat-sirna与外源性fabp4或铁死亡抑制剂的联合方案，实验证实具有协同增效作用。

28、第三，局部给药、系统风险低。本发明的技术方案采用关节腔局部给药，sirna直接作用于靶细胞，避免全身暴露；配合脂质纳米颗粒、透明质酸水凝胶等缓释载体可实现长效驻留，给药频率低，患者顺应性好；而且提供多种递送载体（脂质纳米颗粒、水凝胶、外泌体、aav载体等），可适应不同临床场景，递送体系灵活，具有良好产业化前景。