一种基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺的制作方法

本发明涉及壳寡糖制备，尤其涉及一种基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺。

背景技术：

1、甲壳素是广泛存在于虾、蟹等海洋生物外壳中的天然多糖，其脱乙酰产物壳聚糖经进一步降解制得的壳寡糖，具有水溶性好、生物利用度高、抑菌、抗氧化、调节免疫等多种生物活性，在医药、保健品、生物敷料及药物控释载体等领域具有广泛的应用前景。

2、目前，工业化生产壳寡糖主要采用酸碱化学法，即先以浓酸脱钙、浓碱脱蛋白从虾蟹壳中提取甲壳素，再经高温浓碱脱乙酰制得壳聚糖，最后通过酸降解或氧化降解获得壳寡糖。

3、但该工艺酸碱耗量大、生产能耗高，且产生大量高盐高浓度有机废水，随着国家对环保要求的日益提高，这种高污染的化学法生产技术已受到越来越严格的限制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，解决了现有技术中因采用酸碱化学法所导致的环境污染严重、酸碱耗量大、废水处理成本高、生产受环保政策限制日益明显的技术问题

2、为实现上述目的，本发明提供了一种基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，包括以下步骤：

3、从自然环境中筛选具有产壳聚糖酶能力的菌株，经菌种鉴定与选育优化后获得壳聚糖酶高产、高特异性目标菌株，将目标菌株扩大发酵培养，制备得到高活性壳聚糖酶液；

4、取虾蟹壳原料，灭菌后依次经产酸脱钙菌株发酵脱钙、调节ph后接入产甲壳素脱乙酰酶菌株与产蛋白酶菌株发酵脱蛋白和脱乙酰，发酵结束后经水洗、干燥，得到精制壳聚糖底物；

5、将精制壳聚糖底物溶于稀酸溶液，加入所述壳聚糖酶液，在30～40℃条件下酶解反应6～10小时；

6、酶解结束后升温灭酶，经板框压滤得到壳寡糖粗酶解液；

7、将壳寡糖粗酶解液依次经超滤膜去除大分子杂质，再经纳滤膜脱盐、脱单糖并实现壳寡糖的分级浓缩，得到壳寡糖精制液；

8、将壳寡糖精制液浓缩后喷雾干燥，得到壳寡糖成品。

9、其中，从自然环境中筛选具有产壳聚糖酶能力的菌株，经菌种鉴定与选育优化后获得壳聚糖酶高产、高特异性目标菌株，将目标菌株扩大发酵培养，制备得到高活性壳聚糖酶液中，所述方法具体包括：

10、以粉末壳聚糖为唯一碳源，采用透明圈法，根据菌株产生的透明圈与菌落直径的比值d/d对产壳聚糖酶菌株进行初步筛选；

11、将初筛菌株进行摇瓶发酵复筛，通过酶活性测定进一步筛选高产菌株，对筛选出的高产菌株进行形态特征观察、生理生化特征鉴定及16s rdna序列分析，完成菌种分类鉴定；

12、采用单克隆选育和/或基因工程改造手段，在摇瓶条件下对鉴定后的菌株进行性能优化，获得壳聚糖酶高产且酶解特异性强的目标菌株；

13、将优化后的目标菌株接种至发酵培养基中，在温度28～37℃、ph6.5～7.5的条件下发酵培养48～72小时，离心或过滤收集含有壳聚糖酶的发酵上清液，即得高活性壳聚糖酶液。

14、其中，取虾蟹壳原料，灭菌后依次经产酸脱钙菌株发酵脱钙、调节ph后接入产甲壳素脱乙酰酶菌株与产蛋白酶菌株发酵脱蛋白和脱乙酰，发酵结束后经水洗、干燥，得到精制壳聚糖底物中，所述方法具体包括：

15、将虾蟹壳原料清洗、粉碎，得到虾蟹壳粗粉；

16、将虾蟹壳粗粉进行灭菌处理；

17、向灭菌后的虾蟹壳粗粉中接入产酸脱钙菌株，接种量为原料干重的1％～5％，控制发酵温度30～35℃、含水率40％～70％，固态发酵24～48小时；

18、将发酵体系ph调节至6.0～7.5，接入产甲壳素脱乙酰酶菌株与产蛋白酶菌株，接种量均为原料干重的1％～3％，控制发酵温度25～35℃，继续固态发酵24～48小时；

19、发酵结束后水洗至中性，于40～60℃干燥，得到脱乙酰度为70％～95％的精制壳聚糖底物。

20、其中，将精制壳聚糖底物溶于稀酸溶液，加入所述壳聚糖酶液，在30～40℃条件下酶解反应6～10小时中，所述方法具体包括：

21、将精制壳聚糖底物加入质量浓度1％～3％的醋酸溶液，配制成质量浓度1％～5％的壳聚糖溶液，调节ph至4.0～6.5；

22、向壳聚糖溶液中加入所述壳聚糖酶液，酶添加量为5～50u/g底物，控制酶解温度30～40℃，搅拌酶解6～10小时，搅拌速度50～200rpm。

23、其中，酶解结束后升温灭酶，经板框压滤得到壳寡糖粗酶解液中，所述方法具体包括：

24、酶解结束后升温至85～95℃保温10～20分钟灭酶；

25、冷却至40～60℃后经板框压滤去除不溶性杂质，收集滤液即为壳寡糖粗酶解液。

26、其中，将壳寡糖粗酶解液依次经超滤膜去除大分子杂质，再经纳滤膜脱盐、脱单糖并实现壳寡糖的分级浓缩，得到壳寡糖精制液中，所述方法具体包括：

27、将壳寡糖粗酶解液通入截留分子量3000～10000da的超滤膜，操作压力0.2～0.6mpa、温度20～40℃，收集透过液；

28、将超滤透过液通入截留分子量200～500da的纳滤膜，操作压力0.5～2.0mpa、温度20～40℃、ph 4.0～6.0，收集纳滤截留液；

29、纳滤过程中向截留液中加入纯水进行渗滤洗涤，直至透过液电导率降至设定阈值以下，得到壳寡糖精制液。

30、其中，将壳寡糖精制液浓缩后喷雾干燥，得到壳寡糖成品中，所述方法具体包括：

31、将壳寡糖精制液在真空度-0.06～-0.09mpa、温度40～60℃条件下浓缩至固含量20％～40％；

32、浓缩液喷雾干燥，进风温度140～160℃、出风温度70～80℃，物料实际受热时间≤5秒，收集干燥粉末；

33、将干燥粉末冷却后真空包装或充氮包装，即得壳寡糖成品。

34、其中，所得壳寡糖成品以精制壳聚糖底物计的产品得率为50％～55％，以氨基葡萄糖计的总糖含量≥98.0％，水不溶物≤0.2％，灼烧残渣≤0.5％，砷含量≤1ppm，产品外观呈白色至类白色粉末、无氧化褐变。

35、本发明的一种基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，以产酸脱钙菌、产甲壳素脱乙酰酶菌与产蛋白酶菌的复合微生物分阶段发酵完全替代传统强酸强碱处理，实现了虾蟹壳预处理阶段的酸碱零排放；通过30～40℃低温酶解配合6～10小时精准时间控制，避免了低分子量壳寡糖的氧化褐变，保障了产品的外观品质与化学稳定性；结合超滤-纳滤双膜法分级纯化及低温喷雾干燥，所得产品总糖含量≥98.0％，呈白色至类白色粉末、无褐变，产品得率达50％～55％，兼具绿色环保、高纯度、高稳定性的优点，适合工业化大规模生产。

1.一种基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，从自然环境中筛选具有产壳聚糖酶能力的菌株，经菌种鉴定与选育优化后获得壳聚糖酶高产、高特异性目标菌株，将目标菌株扩大发酵培养，制备得到高活性壳聚糖酶液中，所述方法具体包括：

3.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，取虾蟹壳原料，灭菌后依次经产酸脱钙菌株发酵脱钙、调节ph后接入产甲壳素脱乙酰酶菌株与产蛋白酶菌株发酵脱蛋白和脱乙酰，发酵结束后经水洗、干燥，得到精制壳聚糖底物中，所述方法具体包括：

4.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，将精制壳聚糖底物溶于稀酸溶液，加入所述壳聚糖酶液，在30～40℃条件下酶解反应6～10小时中，所述方法具体包括：

5.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，酶解结束后升温灭酶，经板框压滤得到壳寡糖粗酶解液中，所述方法具体包括：

6.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，将壳寡糖粗酶解液依次经超滤膜去除大分子杂质，再经纳滤膜脱盐、脱单糖并实现壳寡糖的分级浓缩，得到壳寡糖精制液中，所述方法具体包括：

7.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，将壳寡糖精制液浓缩后喷雾干燥，得到壳寡糖成品中，所述方法具体包括：

8.如权利要求1所述的基于酶解甲壳素制备壳寡糖的工艺，其特征在于，