梨转录因子PbrBEH3及其应用

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨转录因子pbrbeh3及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个响应油菜素甾醇信号、调控梨果实石细胞木质素合成的bzr/bes家族成员pbrbeh3基因。

背景技术：

1、细胞是梨果肉中特有的厚壁组织细胞，其本质是次生细胞壁（特别是木质素）大量沉积的结果。石细胞含量过高，导致口感粗糙，严重影响了梨果的食用品质和商品价值。因此，解析石细胞形成的分子调控机制，对改良梨果实品质具有重要意义。

2、植物激素在果实发育和品质形成中扮演着关键角色。已有研究表明，赤霉素和生长素等激素参与调控梨果实石细胞的形成。油菜素甾醇是一类重要的植物激素，广泛参与植物生长发育的多个过程。然而，油菜素甾醇信号通路在梨果实石细胞形成中的作用及其分子机制尚不明确。

3、bzr/bes转录因子家族是油菜素甾醇信号通路的核心组分，负责调控下游多种响应基因的表达。在拟南芥中，该家族成员已被证实参与调控细胞伸长、光形态建成等多种生理过程。在梨中，部分bzr/bes家族成员的功能已有报道，例如pbrbzr1参与调控花粉管生长，但关于其家族其他成员，特别是beh3亚家族成员在石细胞形成中的功能，目前尚未见任何报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一个响应油菜素甾醇信号、调控梨果实石细胞木质素合成的pbrbeh3基因。

2、本发明的另一目的是提供该基因的应用。

3、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

4、一种分离自梨的转录因子pbrbeh3基因，属于bzr/bes转录因子家族成员，其核苷酸序列为seq id no.1所示，包含756 bp的开放阅读框；编码252个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表seq id no.2 所示。

5、本发明所述pbrbeh3基因的基因敲除载体。

6、所述的基因敲除载体，聚合表达针对pbrbeh3靶基因的sgrna以及cas9蛋白编码基因的骨架载体为pcgs710h（cn117264947a公开）。

7、含有本发明所述pbrbeh3基因的宿主菌。

8、克隆本发明所述pbrbeh3基因cdna序列的引物对，上游引物pbrbeh3-f1序列如seqid no.3所示，下游引物pbbeh3-r1序列如seq id no.4所示。

9、敲除本发明所述pbrbeh3基因的两个sgrna序列如seq id no.5和seq id no.6所示

10、本发明所述pbrbeh3基因在调控石细胞及形成其组分木质素合成中的应用。

11、本发明所述的重组表达载体在促进石细胞形成及其组分木质素合成的应用。

12、抑制所述的pbrbeh3基因在抑制梨果实石细胞生成及木质素合成中的应用。

13、所述的基因敲除载体在抑制梨果实石细胞中木质素合成中的应用。

14、检测所述的pbrbeh3基因的试剂的以下任意一种应用：

15、（1）筛选石细胞中低木质素含量的梨中的应用；

16、（2）梨分子育种中的应用。

17、作为本发明的一种优选，所述的检测所述的pbrbeh3基因的试剂为pbrbeh3基因的特异性引物。

18、有益效果

19、与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

20、本发明首次揭示了油菜素甾醇信号通路通过转录因子pbrbeh3调控梨果实石细胞木质素合成的分子机制。研究发现，外源油菜素甾醇处理能够显著促进梨果实石细胞的形成和木质素的积累。通过共表达网络分析和关联分析，本发明筛选并鉴定了关键调控基因pbrbeh3，其在206份梨种质中的表达量与石细胞含量呈显著正相关。通过在梨果实中瞬时过表达、在梨果肉愈伤组织中稳定过表达以及构建拟南芥转基因植株，本发明证实了pbrbeh3能够显著促进木质素的合成和石细胞的形成；而敲除pbrbeh3则导致木质素含量显著降低。分子机制研究表明，油菜素甾醇信号诱导pbrbeh3蛋白在细胞核内积累，pbrbeh3通过直接结合下游靶基因pbr4cl1和pbrmyb169启动子中的e-box或brre顺式作用元件，激活其转录，进而启动一系列木质素合成相关基因的表达，最终促进石细胞木质素的沉积。本发明首次构建了从油菜素甾醇信号到梨石细胞形成的完整调控通路，补充完善了梨果实石细胞木质素代谢调控机制，为通过分子育种改良梨果实石细胞含量提供了新的理论依据和重要的基因资源。

1.一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞形成的pbrbeh3基因，其cds序列如seq id no.1所示，编码的蛋白序列如seq id no.2所示。

2.含有权利要求1所述pbrbeh3基因的重组表达载体。

3.权利要求1所述pbrbeh3基因的基因敲除载体。

4.根据权利要求3所述的基因敲除载体，其特征在于，所述的基因敲除载体，以pcgs710h为骨架载体，聚合表达针对pbrbeh3基因的sgrna1和sgrna2以及cas9蛋白编码基因，所述的sgrna1序列如seq id no.5所示，sgrna2序列如seq id no.6所示。

5.含有权利要求2所述的重组表达载体或含有权利要求3所述的基因敲除载体的宿主菌。

6.敲除权利要求1所述pbrbeh3基因的sgrna，其特征在于sgrna1序列如seq id no.5所示，sgrna2序列如seq id no.6所示。

7.权利要求1所述的基因、权利要求2所述的重组表达载体在促进石细胞形成及其组分木质素合成中的应用。

8.抑制权利要求1所述的pbrbeh3基因在抑制梨果实石细胞生成及木质素合成中的应用。

9.权利要求3或4所述的基因敲除载体、权利要求6所述的sgrna在抑制梨果实石细胞中木质素合成中的应用。

10.检测权利要求1所述的pbrbeh3基因的试剂的以下任意一种应用：