一种基于RPA-CRISPR的玉米细菌性条斑病菌检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及病原菌分子检测，特别是涉及一种基于rpa-crispr的玉米细菌性条斑病菌检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、玉米（

zea maysl.）是全球的主要粮食作物，在粮食、饲料、工业等多方面都占有重要地位，提高玉米产量对维护粮饲和工业应用安全有着举足轻重的作用。玉米生长过程中，从发芽到收获会受到多种生物和非生物胁迫，这些都会显著降低产量。随着全球气候变化的加剧，这些生物和非生物胁迫严重性预计将显著增加。其中，病害是最重要的生物胁迫之一，及时有效地发现和管理玉米中的疾病，尤其是由真菌、细菌和病毒等病原体引起的病害，对于保持农业发展和食品安全非常重要。正是由于玉米需求旺盛，跨区域调运活动日趋频繁，进一步加剧了检疫性种传病害扩散蔓延的潜在风险。

2、玉米细菌性条斑病（bls）主要是由黄单胞菌（

xanthomonas

vasicolapv.

vasculorum，

xvv）引起。玉米细菌性条斑病的致病因子最早于1949年被报道，随后逐渐蔓延传播，bls在全球范围内不断增加，但目前玉米细菌性条斑病菌的化学防治尚未被报道。

3、玉米细菌性条斑病的症状表现为叶片上最初出现2-3 mm的小斑点，随后演变为细长狭窄的病斑，周围环绕着黄色晕染，仅限于叶脉间区。这些病斑可能沿叶片延伸，通常被主脉限制，也可能在植物的穗部发育。在光线照射下观察时，病变呈半透明。细菌主要通过伤口进入植物（由风和昆虫摄食受伤等环境因素造成的撕裂或死亡组织），通常通过自然开口（通过气孔、皮孔和水孔），不直接穿过未破损的细胞壁。此外，细菌也可通过伤口进入，并在伤口汁液或雨水或露水薄膜中繁殖。

4、检测病原细菌的技术有多种，如pcr技术、环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermal amplification，lamp）、实时荧光pcr技术、基于锁式探针的滚环扩增技术（rolling circle amplification，rca）等。但目前对于玉米种子中

xvv的检测最经典的方法依旧是利用半选择性琼脂培养基进行稀释平板培养，近年来，科研人员通过建立常规pcr、实时荧光定量pcr以及实时taqman rt-pcr检测体系，较快速、特异且灵敏地检出玉米中的

xvv。但这些方法均存在一定的局限性，常规pcr与rt-pcr需要热循环仪且耗时，实时taqman rt-pcr需要设计良好的探针和昂贵设备。重组酶聚合酶扩增（rpa）是一种等温扩增核酸的方法，最佳温度（37-42℃）下，反应迅速进行，使dna从少数靶拷贝特异性扩增至可检测水平，只需一对引物即可在38℃下30分钟左右完成反应，使用简单设备即可进行反应。

5、crispr/cas系统是细菌和古细菌的一种适应性免疫机制，其中crispr/cas12a具备独特的双模式切割活性，既可顺式切割双链dna（dsdna）靶标，又可反式切割单链dna（ssdna）报告探针，因此，该系统已成为分子检测的常用工具。研究人员将rpa扩增技术与crispr/cas特异性识别机制相结合，建立了一种田间快速检测玉米内州萎蔫病菌的rpa-crispr技术，但是对于

xvv致病菌的rpa检测方法，本领域尚未见报道。因此，本发明拟采用rpa-crispr/cas体系对玉米细菌性条斑病菌进行检测，以满足田间常态化检疫与应急防控需求，为农作物生物安全防控及粮食安全保障提供新技术途径。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于rpa-crispr的玉米细菌性条斑病菌检测试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明为检测玉米细菌性条斑病菌提供了一种灵敏度高、反应时间短、不依赖专业仪器、操作简便的方法，为农作物生物安全防控及粮食安全保障提供了新的技术途径。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供了一种基于rpa-crispr/cas12a的试剂盒，包括核苷酸序列如seq idno.1-2所示的rpa引物对、核苷酸序列如seq id no.11所示的crrna、cas12a蛋白和核苷酸序列如seq id no.13所示的试纸条报告分子。

4、进一步地，所述cas12a蛋白为lbacas12a。

5、本发明还提供了一种上述的试剂盒在制备检测玉米细菌性条斑病菌的产品中的应用，所述玉米细菌性条斑病菌为

xanthomonas vasicolapv.

vasculorum。

6、本发明还提供了一种检测玉米细菌性条斑病菌的产品，包括上述的试剂盒。

7、本发明还提供了一种上述的试剂盒或上述的产品在检测玉米细菌性条斑病菌中的应用，所述玉米细菌性条斑病菌为

xanthomonas vasicolapv.

vasculorum。

8、本发明还提供了一种检测玉米细菌性条斑病菌的方法，所述方法使用上述的试剂盒或上述的产品进行检测，包括以下步骤：

9、提取待测样品的总dna，使用所述rpa引物对进行rpa扩增反应，收集扩增产物；

10、将所述扩增产物进行crispr/cas12a反应，crispr/cas12a反应结束后，进行试纸条检测；

11、根据所述试纸条检测的结果鉴定所述待测样品中是否含有所述玉米细菌性条斑病菌；

12、所述玉米细菌性条斑病菌为

xanthomonas vasicolapv.

vasculorum。

13、进一步地，所述rpa扩增反应的温度为39-45℃，时间为10-30 min。

14、进一步地，所述crispr/cas12a反应的反应体系包括：

15、所述扩增产物、所述crrna、所述cas12a蛋白、所述试纸条报告分子、核酸酶抑制剂和缓冲液。

16、进一步地，所述反应体系中，所述试纸条报告分子的终浓度为12-32 nmol/l。

17、进一步地，所述crispr/cas12a反应的时间为10-30 min。

18、本发明公开了以下技术效果：

19、本发明通过基因组筛选和序列设计，获得了特异性检测玉米细菌性条斑病菌的rpa引物对和crrna。本发明还建立了基于rpa扩增和crispr/cas12a切割识别的胶体金试纸条检测体系，实验结果表明，该检测体系的检测灵敏度为1 pg/μl，总检测时间缩短至35min。本发明为检测玉米细菌性条斑病菌提供了一种灵敏度高、反应时间短、不依赖专业仪器、操作简便的方法，可满足田间常态化检疫与应急防控需求，为农作物生物安全防控及粮食安全保障提供了新的技术途径。