eIDR多肽及其应用

本发明涉及酶工程和生物，具体地说，涉及eidr多肽及其应用。

背景技术：

1、大肠杆菌(e. coli)表达系统以其生长快速、成本可控及产量高等优势，成为外源蛋白工业生产的首选平台，但其过度表达诱导蛋白质聚集形成包涵体，影响了蛋白的后续开发与应用。为了克服这些限制，目前的研究主要集中在开发和优化各种融合标签，以促进蛋白的可溶性表达。

2、酶作为一类高效生物催化剂，与传统化学催化剂相比，具有底物特异性高、催化效率显著以及环境友好等突出优势，在众多工业领域发挥着关键作用。随着酶应用范围的持续扩大，市场对其产量提出了更高要求。然而，部分酶因其天然表达水平较低，产量不足已成为制约其大规模工业化生产和应用的关键瓶颈。

3、蛋白液-液相分离通过构建稳定且高浓度的环境，将酶分子与其底物、辅因子在狭小空间内的高度富集，极大地增加了有效碰撞的频率，从而在低整体浓度下实现极高的局部反应速率。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供辣椒疫霉效应因子nlp869的内在无序区(effectorintrinsically disordered region, eidr)及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供了一种用于促进目的蛋白可溶性表达、提高酶催化活性或用于蛋白纯化的eidr多肽，eidr多肽选自以下(a)或(b)：

3、(a) 由seq id no:1所示的氨基酸序列组成的多肽；

4、(b) 在seq id no:1所示氨基酸序列中经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成且具有同等功能的衍生肽。

5、在本发明的实施方案中，衍生肽可以选自(i)或(ii)：

6、(i) 将seq id no:1所示多肽中的天冬氨酸、谷氨酸全部替换成赖氨酸得到的，记为eidrh；

7、(ii) 在seq id no:1所示多肽或(i)的衍生肽的基础上，增加至少1个tpap四肽重复序列得到的。

8、在优选的实施方案中，在seq id no:1所示多肽或(i)的衍生肽的基础上，增加5个tpap四肽重复序列得到的，记为eidrh-15r。

9、在进一步优选的实施方案中，衍生肽eidrh和eidrh-15r的氨基酸序列分别如seq idno:2和seq id no:3所示。

10、第二方面，本发明提供了上述eidr多肽在以下中的应用：

11、1) 作为蛋白纯化标签的应用；2) 提高目的蛋白的可溶性表达；3) 提高酶的催化活性。

12、在本发明的实施方案中，目的蛋白可以为例如酶。在具体实施方案中，酶可以为nadh氧化酶(nox)、几丁质酶(chi)、tev蛋白酶(tevp)、单宁酶(tah)、肠激酶(ek)或人鼻病毒3c蛋白酶(hrv 3cp)。

13、第三方面，本发明提供了融合蛋白，该融合蛋白包含目的蛋白以及与目的蛋白融合的eidr多肽。

14、在本发明的实施方案中，目的蛋白与eidr多肽直接通过肽键连接。

15、在本发明的实施方案中，目的蛋白为酶。在具体实施方案中，酶可以选自nadh氧化酶(nox)、几丁质酶(chi)、tev蛋白酶、单宁酶(tah)、肠激酶(ek)或人鼻病毒3c蛋白酶 (hrv3cp)等中的一种。

16、在本发明的实施方案中，eidr多肽融合于所述目的蛋白的n端或c端。

17、第四方面，本发明提供了利用eidr多肽纯化目的蛋白的方法，包括以下步骤：

18、(1) 提供包含所述融合蛋白的细胞裂解液；

19、(2) 将所述细胞裂解液置于低盐缓冲液中，诱导所述融合蛋白发生液-液相分离形成凝聚体；

20、(3) 通过离心分离并收集步骤(2)中形成的所述凝聚体；

21、(4) 将收集的所述凝聚体用高盐缓冲液重悬，使所述凝聚体复溶，从而得到包含纯化的所述目的蛋白的溶液。

22、在本发明的实施方案中，目的蛋白为eidr-gfp。

23、在本发明的实施方案中，步骤(2)还包括向所述细胞裂解液中加入分子拥挤剂以促进所述液-液相分离。

24、在本发明优选的实施方案中，分子拥挤剂为peg 8000。

25、第五方面，本发明提供了eidr多肽或融合蛋白即eidr融合酶在制备用于提高酶催化活性的组合物中的应用。

26、第六方面，本发明提供了提高酶催化活性的方法，所述方法包括将eidr多肽与目的蛋白融合，形成融合蛋白，将融合蛋白置于能够诱导其发生液-液相分离的反应体系中进行酶促反应。

27、在本发明的实施方案中，目的蛋白可以为酶。在具体实施方案中，酶可以为nadh氧化酶(nox)、几丁质酶(chi)、tev蛋白酶、单宁酶(tah)、肠激酶(ek)或人鼻病毒3c蛋白酶(hrv 3cp)，优选nox。

28、在本发明的实施方案中，反应体系可以为低盐缓冲液。

29、在本发明的实施方案中，低盐缓冲液是指含30 mm hepes、30 mm nacl且ph 7.5的缓冲液。在本发明的实施方案中，高盐缓冲液是指含30 mm hepes、600 mm nacl且ph 7.5的缓冲液。

30、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果。本发明的eidr多肽可以促进多种酶的可溶性表达，且能够提高几丁质酶、nadh氧化酶(nox)的活性。此外eidr还可以作为蛋白纯化标签用于纯化目的蛋白，为工业大规模应用奠定了基础。

1.一种用于促进目的蛋白可溶性表达、提高酶催化活性或用于蛋白纯化的eidr多肽，其特征在于，所述多肽选自以下(a)或(b)：

2.根据权利要求1所述的eidr多肽，其特征在于，所述衍生肽选自(i)或(ii)：

3.权利要求1或2所述eidr多肽在以下中的应用：

4.融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含目的蛋白，以及与所述目的蛋白融合的如权利要求1或2所述的eidr多肽，其中所述目的蛋白为酶。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述酶选自nadh氧化酶、几丁质酶、tev蛋白酶、单宁酶、肠激酶或人鼻病毒3c蛋白酶中的一种。

6.根据权利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述eidr多肽融合于所述目的蛋白的n端或c端。

7.利用权利要求1或2项所述eidr多肽纯化目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括向所述细胞裂解液中加入分子拥挤剂以促进所述液-液相分离。

9.权利要求1或2所述eidr多肽或权利要求4-6中任一项所述融合蛋白在制备用于提高酶催化活性的组合物中的应用。

10.一种提高酶催化活性的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4所述融合蛋白置于能够诱导其发生液-液相分离的反应体系中进行酶促反应。