一种磁性共价有机框架材料固定化β-D-葡萄糖苷酶及其在转化人参皂苷Rb1中的应用

本发明涉及一种基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶及其用于转化人参皂苷 rb1的方法，属于中药生物。

背景技术：

1、人参皂苷rb1是人参中的主要皂苷成分，属于原人参二醇型。根据特定的转化条件，通过水解人参皂苷rb1的糖基可转化为具有更高的生理活性的稀有人参皂苷，如人参皂苷rh2和rg3。在科学研究和实际应用中对具有更高的生理活性的稀有人参皂苷有较大的需求。

2、水解人参皂苷rb1的糖基可将其转化为具有更高的生理活性的稀有人参皂苷，β-d-葡萄糖苷酶水解法是常用的方法，所使用的酶多为游离酶，无法重复使用，这使得分离成本增加，另外游离酶易受外界环境变化的影响，导致酶活性降低甚至完全丧失。

技术实现思路

1、为解决通常的使用游离酶所存在的上述缺陷，本发明提供了一种基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶方法。将四苯氨基苯、四氟对苯二甲醛和氨基磁性微球混合，四苯氨基苯与四氟对苯二甲醛混合通过希夫碱反应制备共价有机框架材料，反应过程中氨基磁性微球同时与体系中的醛基反应，一锅法制备得到基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性共价有机框架材料。再将β-d-葡萄糖苷酶通过化学键合的方式固定到磁性共价有机框架材料上，从而得到磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶及其用于转化人参皂苷 rb1的方法，由磁性共价有机框架材料的合成、β-d-葡萄糖苷酶的固定化及固定化酶应用于水解转化人参皂苷rb1等内容与步骤组成。

4、本发明一种磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，所述磁性磁性共价有机框架材料是一种基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性磁性共价有机框架材料，所述固定化为利用磁性磁性共价有机框架材料对β-d-葡萄糖苷酶的吸附作用进行β-d-葡萄糖苷酶的固定化。所述磁性磁性共价有机框架材料的制备方法是，以四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体，以氨基磁性微球为磁性载体，以离子液体为溶剂，以羧基功能化离子液体为催化剂，通过希夫碱反应制备。

5、所述磁性共价有机框架材料的合成以四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体，以氨基磁性微球为磁性载体，以离子液体为溶剂，以羧基功能化离子液体为催化剂，通过希夫碱反应制备。四苯氨基苯、四氟对苯二甲醛、氨基磁性微球的投料比例为0.05 mmol:0.10mmol:20mg。

6、所述氨基磁性微球为以无水醋酸钠、六水三氯化铁、乙二醇、己二胺为原料合成，其最优比例为2g:1g:30ml:5ml，最优反应温度为190℃，最优反应时间为6h。反应完成后用水洗涤3-5次，再用甲醇洗涤3-5次。

7、所述离子液体溶剂为1-乙基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐，1-丁基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐，1-己基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐其中的一种或其混合物。离子液体体积与四苯氨基苯的物质的量的比例为100-1000µl/0.05mmol，最优为200-400µl/0.05mmol。

8、所述羧基功能化离子液体催化剂为1-羧基3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐。

9、所述希夫碱反应的反应温度为室温至100℃，最优为70℃-85℃，反应时间为12-72h，最优为36-48h。

10、所述β-d-葡萄糖苷酶的固定化为利用共价有机框架材料对β-d-葡萄糖苷酶的吸附作用进行β-d-葡萄糖苷酶的固定化，β-d-葡萄糖苷酶与共价有机框架材料的质量比为1:3，固定化介质为0.02m ph=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，固定化方式为室温振荡，振荡时间为2-6h。

11、所述固定化酶应用于水解转化人参皂苷rb1的介质为0.02m ph=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；人参皂苷rb1初始浓度为0.5%-2.0%,最优为1.0%；水解时间为6-24h，水解温度为40-60℃，最优为50℃。

12、本发明一种基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶及其用于转化人参皂苷 rb1的方法，其突出效果是将酶固定化至磁性有机框架材料载体上，酶的构象相对更加稳定，不易受外界环境（如ph值、温度、抑制剂等）的影响而失活。固定化酶具有更高的操作稳定性和储存稳定性。借助于其磁性，固定化酶更易于回收重复使用，成本低，实用性极强。

1.一种磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述磁性磁性共价有机框架材料是一种基于四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体的磁性磁性共价有机框架材料，所述固定化为利用磁性磁性共价有机框架材料对β-d-葡萄糖苷酶的吸附作用进行β-d-葡萄糖苷酶的固定化。

2.根据权利要求1所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述磁性磁性共价有机框架材料的制备方法是，以四苯氨基苯和四氟对苯二甲醛为单体，以氨基磁性微球为磁性载体，以离子液体为溶剂，以羧基功能化离子液体为催化剂，通过希夫碱反应制备。

3.根据权利要求2所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，四苯氨基苯、四氟对苯二甲醛、氨基磁性微球的投料比例为0.05 mmol:0.10mmol:20mg。

4.根据权利要求2所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述氨基磁性微球为以无水醋酸钠、六水三氯化铁、乙二醇、己二胺为原料合成，其最优比例为2g:1g:30ml:5ml，最优反应温度为190℃，最优反应时间为6h。反应完成后用水洗涤3-5次，再用甲醇洗涤3-5次。

5.根据权利要求2所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述离子液体溶剂为1-乙基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐，1-丁基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐，1-己基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐其中的一种或其混合物。离子液体体积与四苯氨基苯的物质的量的比例为100-1000µl/0.05mmol，最优为200-400µl/0.05mmol。

6.根据权利要求2所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述羧基功能化离子液体催化剂为1-羧基3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐。

7.根据权利要求2所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述希夫碱反应的反应温度为室温至100℃，最优为70℃-85℃，反应时间为12-72h，最优为36-48h。

8.根据权利要求1所述的磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶，其特征在于，固定化介质为0.02m ph=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，固定化方式为室温振荡，振荡时间为2-6h，β-d-葡萄糖苷酶与共价有机框架材料的质量比为1:3。

9.根据权利要求1-8任一所述磁性共价有机框架材料固定化β-d-葡萄糖苷酶在转化人参皂苷 rb1中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，介质为0.02m ph=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；人参皂苷rb1初始浓度为0.5%-2.0%,最优为1.0%；水解时间为6-24h，水解温度为40-60℃，最优为50℃。