OsPi3/4k3基因在提高水稻耐盐性中的应用的制作方法

本发明属于基因工程，涉及

ospi3/4k3基因在提高水稻耐盐性中的应用。

背景技术：

1、土壤盐渍化是制约全球水稻生产、影响耕地利用效率的重要非生物胁迫因素。我国盐碱地分布广泛、面积辽阔，且设施农业次生盐渍化问题日益突出，严重限制了水稻种植区域的拓展与水稻高产稳产。水稻属于典型的盐敏感型作物，苗期是水稻整个生育期中对盐胁迫最为敏感的关键时期，盐胁迫会显著抑制水稻种子萌发、根系伸长与幼苗生长，造成幼苗枯萎、存活率大幅下降，最终导致水稻群体不足、产量显著降低。因此，挖掘水稻耐盐关键基因、解析耐盐分子机制、创制稳定遗传的耐盐突变种质，是开展水稻耐盐分子育种、改良水稻耐盐农艺性状的核心关键。

2、植物耐盐性是由多基因调控的复杂数量性状，依赖于功能基因的精准表达调控。基因的表达模式并非仅由编码区序列决定，基因启动子及5'非翻译区（5' utr）作为重要的顺式调控区域，能够通过调控转录起始效率、mrna稳定性、mrna二级结构折叠及核糖体翻译结合效率，精准调控基因的时空表达水平，在植物抗逆性状调控中发挥着不可替代的作用。相较于编码区突变容易造成蛋白功能缺失、植株畸形发育等负面表型，5' utr区域的碱基缺失、替换等微突变能够在不改变基因编码蛋白氨基酸序列的前提下，温和调控基因表达量，实现作物抗逆性状的精准改良，是现代分子设计育种的优质突变靶点。

3、现有技术中，关于水稻

ospi3/4k3基因的功能研究鲜有报道，目前尚无公开技术揭示

ospi3/4k3基因与水稻苗期耐盐性的关联关系，更未涉及通过

ospi3/4k3基因5' utr区域定向突变改良水稻耐盐性的相关技术方案。现有水稻耐盐育种多依赖传统诱变、杂交选育等手段，存在育种周期长、定向改良精度低、连锁不良性状多、耐盐种质资源匮乏等诸多缺陷。同时，现有基因编辑耐盐育种多聚焦于基因编码区敲除或过表达，易导致植株正常生长发育受影响，难以兼顾水稻抗逆性与生长优势。

4、针对现有技术的缺陷，本发明通过定向创制

ospi3/4k3基因5' utr区单碱基缺失突变体，证实该位点突变可显著下调

ospi3/4k3基因在水稻苗期的表达水平，解除该基因对水稻耐盐通路的负调控作用，显著提升水稻苗期盐胁迫耐受性。本发明填补了

ospi3/4k3基因在水稻耐盐育种中的技术空白，提供了一种精准、高效、无不良连锁效应的水稻耐盐改良新靶点与新方法，对培育耐盐水稻新品种、开发利用盐碱耕地、保障水稻安全生产具有重要的理论价值与应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有水稻耐盐育种技术中耐盐基因靶点匮乏、常规育种周期长、定向改良精度低，且现有基因编辑技术多改造基因编码区，易造成水稻植株发育异常、农艺性状劣变的技术缺陷，提供一种突变型

ospi3/4k3基因在水稻苗期耐盐性调控中的全新应用。本发明旨在挖掘水稻耐盐新靶点，提供一种基于基因5' utr精准微突变的耐盐改良方案，在不改变

ospi3/4k3基因编码蛋白序列、不影响水稻正常生长发育的前提下，通过调控基因表达水平显著提升水稻苗期耐盐能力，解决传统耐盐育种改良效果差、副作用大、种质资源稀缺的技术难题，为水稻耐盐分子设计育种提供全新的基因资源与技术支撑。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种培育耐盐水稻植株的方法，在水稻植株基因组的

ospi3/4k3基因中引入单碱基缺失突变，即以

ospi3/4k3基因起始密码子atg中的a为0位，在基因上位于起始密码子atg上游的473位缺失一个碱基c，从而获得核苷酸序列如seq idno.4所示的突变型

ospi3/4k3基因，进而获得耐盐性提高的水稻植株；所述突变型

ospi3/

4k3基因用sgrna进行构建；所述sgrna的序列如seq id no.5所示。

4、进一步地，所述在水稻植株基因组的

ospi3/4k3基因中引入单碱基缺失突变，所述缺失突变能够显著下调水稻苗期

ospi3/4k3基因的转录表达水平，解除该基因对水稻耐盐响应通路的负调控作用，进而提高水稻苗期耐盐性，包括以下步骤：

5、步骤一、构建crispr/cas9基因编辑载体，所述载体靶向

ospi3/4k3基因上如seqid no.5所示的核苷酸序列；所述

ospi3/4k3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述

ospi3/4k3基因编码的氨基酸序列如seq id no.3所示；

6、步骤二、构建含步骤一所述crispr/cas9基因编辑载体的农杆菌基因工程菌；

7、步骤三、将步骤二所述农杆菌基因工程菌转化水稻植株，获得携带所述单碱基缺失突变的水稻。

8、进一步地，所述水稻的品种为日本晴。

9、本发明第二方面提供了利用上述的方法培育的耐盐水稻植株。

10、本发明第三方面提供了上述耐盐水稻植株在水稻耐盐品系选育中的应用。

11、本发明第四方面提供了一种水稻耐盐品系的选育方法，包括：以上述方法获得的耐盐性水稻作为亲本，与目标材料进行杂交，获得的f1代与目标材料进行回交，从而获得具有耐盐性的回交后代。

12、进一步地，所述耐盐性的回交后代和所述亲本具有相同的突变型

ospi3/4k3基因；所述

ospi3/4k3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述突变型

ospi3/4k3基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

13、本发明的有益效果：

14、（1）首创性挖掘全新耐盐基因靶点，填补技术空白：本发明首次明确证实ospi3/4k3基因参与水稻苗期盐胁迫响应，证实该基因为水稻耐盐负调控基因，通过下调其表达可显著提升水稻耐盐性。突破了现有水稻耐盐育种的基因靶点局限，为水稻抗逆育种提供了全新的基因资源与育种靶点，具有极高的原创性与科研价值。

15、（2）采用5' utr微突变，无植株发育副作用：本发明区别于传统编码区敲除、过表达等改造方式，仅对ospi3/4k3基因5' utr非编码区进行单碱基缺失突变，不改变基因编码的氨基酸序列，不影响水稻正常生理发育、株型及产量性状。仅通过调控基因转录表达量实现耐盐性状改良，彻底规避了传统基因编辑导致的植株畸形、生长迟缓、产量下降等不良连锁性状，实现了抗逆性与农艺性状的完美兼顾。

16、（3）改良效果精准、耐盐性状提升显著：本发明的定点单碱基缺失突变可稳定下调ospi3/4k3基因表达，有效解除其对水稻耐盐通路的抑制作用。在盐胁迫条件下，突变体水稻苗期存活率显著提升，根系生长受抑制程度显著降低，叶片枯萎衰老程度减轻，苗期生物量积累显著优于野生型，苗期耐盐抗逆能力提升效果稳定、可遗传性强。

17、（4）育种效率高、应用场景广泛：本发明的突变位点精准、遗传背景干净，可通过基因编辑快速创制纯合突变株系，相较于传统杂交育种、理化诱变育种，大幅缩短育种周期，降低育种成本。创制的耐盐突变种质可广泛应用于盐碱地水稻种植、耐盐水稻新品种选育、抗逆种质资源创新等领域，对改良盐碱地耕地利用率、保障水稻高产稳产、拓展水稻种植区域具有重要的实际应用价值与产业前景。