双色测序方法和试剂盒与流程

本发明涉及生物检测，具体涉及双色测序方法和试剂盒。

背景技术：

1、单分子测序源于helicos biosciences corporation公司，利用tirf显微镜达到边合成边测序的效果。单分子测序过程中，按照每一次聚合反应添加的核苷酸或其类似物种类的数量，单分子测序可以分为单色测序和多色测序，其中，多色测序又可以分为双色测序、四色测序。

2、单色测序试剂盒是每次只添加一个有荧光标记的单核苷酸，需要四轮才能完成四个核苷酸的反应，测序时长长，读长短。双色测序试剂盒是da-atto647n、dt-atto532和dg-atto647n、dc-atto532两两混合进行测序，需要两轮才能完成四个核苷酸的反应，相对于单色测序试剂盒，整体测序时间能缩短近似一半，但是测序读长及测序时间仍然是一个局限。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了基于可逆终止核苷酸及其衍生物的双色测序方法和试剂盒。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种双色测序方法，包括如下步骤：

4、（a）使四种可逆终止子与连接于表面的核酸分子发生聚合反应，四种可逆终止子各自独立地包括：核苷酸或其衍生物，标记单元，以及连接所述核苷酸或其衍生物和所述标记单元的第一可切割基团，其中，所述标记单元选自荧光基团和/或特异性结合标记，四种修饰核苷酸中的至少两种分别带有光学可区分的第一荧光基团和第二荧光基团，四种修饰核苷酸中的一种或两种带有特异性结合标记，所述特异性结合标记能够与对应的配偶体特异性结合；

5、（b）激发荧光基团发光，采集发光信号获得第一图像；

6、（c）加入标记物，所述标记物包括偶配体和结合在所述偶配体上的荧光基团，使所述标记物的偶配体与所述特异性结合标记结合，其中，结合在所述偶配体上的荧光基团选自所述第一荧光基团或所述第二荧光基团；

7、（d）激发荧光基团发光，采集荧光基团的发光信号获得第二图像：

8、（e）基于第一图像和第二图像中同一位置的发光信号及其变化，确定参与聚合反应的可逆终止子类型。

9、作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，四种修饰核苷酸中两种的标记单元分别为光学可区分的第一荧光基团和第二荧光基团，四种修饰核苷酸中另两种的标记单元为特异性结合方式不同的特异性结合标记，

10、步骤（c）中，标记物包括两种，且两种所述标记物分别带有第一荧光基团和第二荧光基团；或

11、四种修饰核苷酸中的两种各自独立地带有第一荧光基团，四种修饰核苷酸中的一种带有第二荧光基团，四种修饰核苷酸中的另一种带有特异性结合标记，

12、步骤（c）中，标记物包括一种，且所述标记物带有第二荧光基团。

13、作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，四种修饰核苷酸中的三种分别带有光学可区分的第一荧光基团和第二荧光基团，四种修饰核苷酸中的另一种带有特异性结合标记，且带有相同荧光基团的两种修饰核苷酸中的一种含包括第二可切割基团，所述第二可切割基团位于连接所述第一可切割基团和所述标记单元，所述第二可切割基团的可切割性强于所述第一可切割基团的可切割性，

14、步骤（c）还包括：对所述第二可切割基团进行切除反应。

15、在一种实施方式中，基于第一图像和第二图像中同一位置的发光信号及其变化，确定参与聚合反应的可逆终止子类型，包括：

16、对于第一图像和第二图像中光学信号不变，且均指示第一荧光基团光学信号的第一位置，确定该位置参与聚合反应的可拟终止子为第一可逆终止子；

17、将第一图像和第二图像中光学信号不变，且均指示第二荧光基团光学信号的第二位置，确定该位置参与聚合反应的可拟终止子为第二可逆终止子；

18、将第一图像和第二图像中光学信号不同，但变化规律不同的第三位置和第四位置，确定该两位置参与聚合反应的可拟终止子分别为第三可逆终止子和第四可逆终止子。

19、作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，四种可逆终止子的结构满足：

20、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

21、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

22、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

23、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

24、或

25、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

26、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

27、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

28、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团-特异性结合标记；

29、或

30、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

31、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

32、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

33、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团-特异性结合标记；

34、或

35、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

36、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团-特异性结合标记；

37、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

38、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团；

39、其中，所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物中的一种，且所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物各不相同。

40、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，所述第一可切割基团选自包含-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6-、-arc6-、和/或二硫键中的至少一种的基团；

41、任选地，所述第一可切割基团选自-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6 -arc6、和/或二硫键中的至少一种；

42、任选地，四种所述可逆终止子均仅含第一可切割基团，且所述第一可切割基团为-n3-或二硫键；

43、任选地，四种所述可逆终止子各自独立地含第一可切割基团和/或第二可切割基团，所述第一可切割基团为-n3-，所述第二可切割基团选自包含二硫键的基团；任选地，所述第二可切割基团为二硫键。

44、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自为红色荧光基团、绿色荧光基团和蓝色荧光基团中的一种；

45、任选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自：atto532、atto647n、atto390、atto rho6g、alexa fluor405、alexa fluor532、gm656、alexafluor647、cy5、if700、rox、cy3、cy5罗丹明染料、花青染料、香豆素染料或枣红蛋白中的一种或多种形成的组合；

46、任选地，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和绿色形成的组合；或所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和蓝色形成的组合；

47、任选地，所述荧光颜色为绿色的荧光基团包括atto532、alexa fluor532、attorho6g或cy3；

48、所述荧光颜色为红色的荧光基团包括：atto647n、cy5、gm656或 alexa fluor647；

49、所述荧光颜色为蓝色的荧光基团包括：atto390、alexa fluor405或香豆素。

50、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，所述特异性结合标记选自生物素、地高辛、半抗原或其功能衍生物中的至少一种。

51、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，所述可逆终止子包括如下组合1~25所示中的至少一组：

52、组合1：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

53、组合2：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

54、组合3：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

55、组合4：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

56、组合5：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

57、组合6：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

58、组合7：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

59、组合8：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

60、组合9：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

61、组合10：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

62、组合11：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

63、组合12：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

64、组合13：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n -biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n；

65、组合14：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

66、组合15：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

67、组合16：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

68、组合17：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

69、组合18：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

70、组合19：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

71、组合20：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

72、组合21：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

73、组合22：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

74、组合23：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

75、组合24：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

76、组合25：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5，

77、任选地，所述组合1~14中，不具有特异性结合标记的可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-替换为-n3-ss-，不具有特异性结合标记的可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-ss-替换为-n3-；和/或

78、所述组合1~14中，将-n3-ss-替换为-ss-；

79、任选地，所述组合15~25中，cy5和/或atto647n替换为gm656或 alexa fluor647；和/或atto532和/或alexa fluor532替换为atto rho6g或cy3；或

80、所述组合15~25中，cy5和/或atto647n替换为蓝光染料中的一种。。

81、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，腺嘌呤核苷酸或其衍生物的工作浓度为10 nmol/l~700 nmol/l、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物的工作浓度为5 nmol/l~60 nmol/l、胞嘧啶核苷酸或其衍生物的工作浓度为10 nmol/l~700 nmol/l和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物的工作浓度为 0.05 nmol/l~5 nmol/l。

82、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，所述核酸分子为单拷贝核酸模板。

83、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序方法一种可能的实现方式，所述方法还包括：

84、（f）重复（a）至（e）一次或多次，以确定所述模板核酸序列.

85、一种双色测序试剂盒，至少包括四种可逆终止子和第一切割试剂，

86、四种可逆终止子各自独立地包括：核苷酸或其衍生物，标记单元，以及连接所述核苷酸或其衍生物和所述标记单元的第一可切割基团，其中，所述标记单元选自荧光基团和/或特异性结合标记，四种修饰核苷酸中的至少两种分别带有光学可区分的第一荧光基团和第二荧光基团，四种修饰核苷酸中的一种或两种带有特异性结合标记，所述特异性结合标记能够与对应的配偶体特异性结合，所述第一切割试剂用于切割所述第一可切割基团；

87、任选地，所述第一切割试剂为有机磷切除试剂；

88、任选地，所述有机磷切除试剂中，有机磷选自三(3-羟丙基)膦、三(2-羧乙基)膦、三羟甲基膦、三苯基膦或三(2-羟乙基)膦中的任意一种或多种；

89、任选地，所述有机磷切除试剂中，有机磷为三(3-羟丙基)膦；

90、任选地，所述三(3-羟丙基)膦的工作浓度为10 mmol/l~100 mmol/l。

91、作为本技术双色测序试剂盒的一种可能的实现方式，四种修饰核苷酸中的三种分别带有光学可区分的第一荧光基团和第二荧光基团，四种修饰核苷酸中的另一种带有特异性结合标记，且带有相同荧光基团的两种修饰核苷酸中的一种含包括第二可切割基团，所述第二可切割基团位于连接所述第一可切割基团和所述标记单元，所述第二可切割基团的可切割性强于所述第一可切割基团的可切割性，

92、所述试剂盒还包括第二切割试剂，所述第二切割试剂用于切割所述第二可切割基团。

93、任选地，所述第二切割试剂为还原剂；

94、任选地，所述还原剂中，所述还原剂选自dtt、谷胱甘肽和/或β-ss-乙醇；

95、任选地，所述还原剂为谷胱甘肽；

96、任选地，所述谷胱甘肽的工作浓度为10 mmol/l~100 mmol/l。

97、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序试剂盒一种可能的实现方式，四种可逆终止子的结构满足：

98、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

99、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

100、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

101、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

102、或

103、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

104、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

105、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

106、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团-特异性结合标记；

107、或

108、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

109、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；

110、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

111、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团-特异性结合标记；

112、或

113、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团；

114、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团-特异性结合标记；

115、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

116、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团；

117、其中，所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物中的一种，且所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物各不相同。

118、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序试剂盒一种可能的实现方式，所述第一可切割基团选自包含-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6-、-arc6-、和/或二硫键中的至少一种的基团；

119、任选地，所述第一可切割基团选自-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6 -arc6、和/或二硫键中的至少一种；

120、任选地，四种所述可逆终止子均仅含第一可切割基团，且所述第一可切割基团为-n3-或二硫键；

121、任选地，四种所述可逆终止子各自独立地含第一可切割基团和/或第二可切割基团，所述第一可切割基团为-n3-，所述第二可切割基团选自包含二硫键的基团；任选地，所述第二可切割基团为二硫键。

122、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序试剂盒一种可能的实现方式，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自为红色荧光基团、绿色荧光基团和蓝色荧光基团中的一种；

123、任选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自：atto532、atto647n、atto390、atto rho6g、alexa fluor405、alexa fluor532、gm656、alexafluor647、cy5、if700、rox、cy3、cy5罗丹明染料、花青染料、香豆素染料或枣红蛋白中的一种或多种形成的组合；

124、任选地，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和绿色形成的组合；或所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和蓝色形成的组合；

125、任选地，所述荧光颜色为绿色的荧光基团包括atto532、alexa fluor532、attorho6g或cy3；

126、所述荧光颜色为红色的荧光基团包括：atto647n、cy5、gm656或 alexa fluor647；

127、所述荧光颜色为蓝色的荧光基团包括：atto390、alexa fluor405或香豆素。

128、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序试剂盒一种可能的实现方式，所述特异性结合标记选自生物素、地高辛、半抗原或其功能衍生物中的至少一种。

129、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序试剂盒一种可能的实现方式，所述可逆终止子包括如下组合1~25所示中的至少一组：

130、组合1：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

131、组合2：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

132、组合3：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

133、组合4：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

134、组合5：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

135、组合6：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

136、组合7：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

137、组合8：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

138、组合9：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

139、组合10：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

140、组合11：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

141、组合12：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

142、组合13：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n -biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n；

143、组合14：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

144、组合15：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

145、组合16：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

146、组合17：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

147、组合18：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

148、组合19：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

149、组合20：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

150、组合21：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

151、组合22：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

152、组合23：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

153、组合24：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

154、组合25：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5，

155、任选地，所述组合1~14中，不具有特异性结合标记的可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-替换为-n3-ss-，不具有特异性结合标记的可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-ss-替换为-n3-；和/或

156、所述组合1~14中，将-n3-ss-替换为-ss-；

157、任选地，所述组合15~25中，cy5和/或atto647n替换为gm656或 alexa fluor647；和/或atto532和/或alexa fluor532替换为atto rho6g或cy3；或

158、所述组合15~25中，cy5和/或atto647n替换为蓝光染料中的一种。。

159、在上述任一实施方式的基础上，作为本技术双色测序试剂盒一种可能的实现方式，腺嘌呤核苷酸或其衍生物的工作浓度为10 nmol/l~700 nmol/l、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物的工作浓度为5 nmol/l~60 nmol/l、胞嘧啶核苷酸或其衍生物的工作浓度为10nmol/l~700 nmol/l和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物的工作浓度为 0.05 nmol/l~5 nmol/l。

160、本发明提供了双色测序方法，包括步骤：

161、步骤1、提供四种可逆终止子：第一可逆终止子、第二可逆终止子、第三可逆终止子和第四可逆终止子，四种所述可逆终止子各自独立地包括：核苷酸或其衍生物，标记单元，以及连接所述核苷酸或其衍生物和所述标记单元的第一可切割基团和/或第二可切割基团，所述核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物；

162、步骤2、所述可逆终止子通过聚合酶链式反应与核酸模板-引物复合物结合并延伸，获得延伸产物；

163、步骤3、激发和采集所述延伸产物的荧光信号，获得第一图像，所述第一图像包括分别来自所述第一可逆终止子、所述第二可逆终止子、所述第三可逆终止子和所述第四可逆终止子的第一信号、第二信号、第三信号和第四信号；

164、步骤4、对所述延伸产物进行第一反应和第二反应，或对所述延伸产物进行第二反应，获得反应产物；

165、步骤5、激发和采集所述反应产物的荧光信号，获得第二图像，所述第二图像包括分别来自所述第一可逆终止子、所述第二可逆终止子、所述第三可逆终止子和所述第四可逆终止子的第五信号、第六信号、第七信号和第八信号；

166、步骤6、根据第一图像和第二图像的光学信号确定与核酸模板-引物复合物结合的可逆终止子的种类；

167、步骤7、对所述反应产物进行第三反应；

168、步骤8、重复步骤2至步骤7一次或多次，以确定所述模板核酸序列；

169、其中，

170、所述标记单元选自：荧光基团与特异性结合标记的组合、荧光基团和特异性结合标记中的至少一种，所述标记物包括偶配体和与所述偶配体结合的荧光基团；

171、当所述可逆终止子同时含有第一可切割基团和第二可切割基团时，所述第一可切割基团和所述第二可切割基团不同，所述第二可切割基团的可切割性强于所述第一可切割基团的可切割性；

172、所述第一反应为切除所述第二可切割基团的反应；

173、所述第二反应为所述偶配体与特异性结合标记之间的结合反应；

174、所述第三反应为切除所述第一可切割基团或切除所述第二可切割基团的反应；

175、所述第一信号、所述第二信号、所述第三信号、所述第四信号、所述第五信号、所述第六信号、所述第七信号和所述第八信号各自独立地为第一亮斑、第二亮斑、第三亮斑和无亮斑中的一种，其中，所述第一亮斑指示第一荧光颜色特征，所述第二亮斑指示第二荧光颜色特征，所述第三亮斑同时指示第一荧光颜色特征和第二荧光颜色特征，

176、且所述第一信号、所述第二信号、所述第三信号、所述第四信号、所述第五信号、所述第六信号、所述第七信号和所述第八信号同时满足下述条件a)~f)：

177、a)所述第一信号与所述第五信号相同，

178、b)所述第四信号与所述第八信号相同，

179、c)所述第一信号与所述第四信号不同，

180、d)所述第二信号与所述第六信号不同，

181、e)所述第三信号与所述第七信号不同，

182、f)所述第六信号和所述第七信号不同和/或所述第二信号与所述第三信号不同。

183、作为本发明双色测序方法的实施情形之一，任选地，所述标记单元包括荧光基团和特异性结合标记，则所述标记单元中的荧光基团和所述标记物中的荧光基团选自颜色可区分的第一荧光基团和第二荧光基团。

184、任选地，具有相同的可切割基团的所述可逆终止子中，至少存在两种标记单元的荧光颜色不同的可逆终止子。

185、任选地，所述第一可切割基团选自包含-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6-、-arc6-、和/或二硫键中的至少一种的基团。

186、任选地，所述第一可切割基团选自-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6、-arc6、和/或二硫键中的至少一种。

187、任选地，所述第一可切割基团为-n3-或二硫键。

188、任选地，所述第二可切割基团选自包含二硫键的基团。

189、任选地，所述第二可切割基团为二硫键。

190、任选地，所述荧光基团选自颜色可区分的第一荧光基团和第二荧光基团。

191、任选地，所述第一信号~第八信号中，

192、所述第一信号、第二信号和所述第五信号相同，所述第四信号和所述第八信号相同，所述第一信号和所述第四信号不同，所述第二信号和所述第三信号不同，且所述第二信号、所述第四信号和所述第六信号互不相同，所述第三信号和所述第七信号互不相同；具体可见表5、4、2或1；

193、或，所述第一信号和所述第五信号相同，所述第四信号和所述第八信号相同，所述第一信号和所述第四信号不同，所述第二信号、所述第一信号和所述第三信号各不相同，所述第三信号、所述第四信号和所述第七信号各不相同；具体可见表3；

194、或，所述第一信号、所述第五信号和所述第六信号相同，所述第三信号、所述第四信号和所述第八信号相同，所述第一信号与所述第三信号不同，所述第二信号分别与所述第一信号、所述第三信号不同，所述第七信号和所述第三信号不同；具体可见表6；

195、或，所述第一信号和所述第五信号相同，所述第四信号和所述第八信号相同，所述第一信号和所述第四信号不同，所述第二信号和所述第三信号相同，且所述第二信号分别与所述第六信号、所述第七信号不同，所述第七信号分别与所述第三信号、所述第六信号不同；具体可见表9或10；

196、或，所述第一信号、所述第三信号和所述第五信号相同，所述第四信号和所述第八信号相同，所述第一信号和所述第四信号不同，所述第二信号和所述第三信号不同，且所述第二信号、所述第一信号和所述第四信号各不相同，所述第三信号、所述第四信号和所述第七信号互不相同；具体可见表7或8。

197、应当理解的是，上述“任选地”对应的情形，可以各自独立且分别出现在不同的实施方式中，当然，也可以任意组合，形成不同的实施方式。

198、在上述实施情形的基础上，进一步任选地，

199、所述第一信号和所述第五信号均选自所述第一亮斑或所述第二亮斑中的一种，所述第四信号和所述第八信号均选自所述第一亮斑或所述第二亮斑中的一种（具体可见表1~10）； 且所述第一信号、所述第二信号、所述第三信号、所述第六信号和所述第七信号满足下述条件1)~4)中的一种：

200、1）所述第二信号选自选自所述第一亮斑或所述第二亮斑，所述第三信号选自所述第一亮斑或所述第二亮斑，所述第六信号为所述无亮斑，所述第七信号为所述第三亮斑；具体可见表2或5；

201、2）所述第二信号选自选自所述第一亮斑或所述第二亮斑，所述第三信号为所述无亮斑，所述第六信号为所述无亮斑，所述第七信号为第一亮斑或所述第二亮斑中的一种；具体可见表1、3或4；

202、3）所述第二信号为所述无亮斑，所述第三信号选自所述第一亮斑或所述第二亮斑，所述第六信号为所述第一亮斑或所述第二亮斑中的一种，所述第七信号为所述第三亮斑；具体可见表6、7或8；

203、4）所述第二信号为无亮斑，所述第三信号为无亮斑，所述第六信号为所述第一亮斑或所述第二亮斑中的一种，所述第七信号为所述第三亮斑；具体可见表9或10。

204、应当理解的是，上述“任选地”对应的情形，可以各自独立且分别出现在不同的实施方式中，当然，也可以任意组合，形成不同的实施方式。

205、结合上述实施情形，本发明所述的双色测序方法包括不同的实现方式，下面结合两种实现方式进行说明，为便于描述，将两种实施方式分别命名为方案1和方案2。

206、方案1中，所述四种可逆终止子中的一个或多个含有所述第一可切割基团，且所述四种可逆终止子中的一个或多个含有所述第二可切割基团；即四种所述可逆终止子所述四种可逆终止子含有的可切割基团为两种，步骤四对所述延伸产物进行第一反应和第二反应，获得反应产物。

207、任选地，所述第一信号、所述第二信号、所述第三信号、所述第六信号和所述第七信号满足条件1)或条件2)，且四种可逆终止子的结构满足：

208、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团，

209、所述第二可逆终止子的结构为如下情形中的一种：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团；或第二核苷酸或其衍生物-第二可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团；

210、所述第三可逆终止子的结构为如下情形中的一种：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；或第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团-特异性结合标记；

211、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

212、所述第二可逆终止子和所述第三可逆终止子不同时含有特异性结合标记；

213、其中，所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物中的一种，且所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物各不相同。

214、任选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自：atto532、atto647n、atto390、atto rho6g、alexa fluor405、alexa fluor532、gm656、alexafluor647、cy5、if700、rox、cy3、cy5罗丹明染料、花青染料、香豆素染料和/或枣红蛋白中的一种或多种形成的组合。

215、任选地，所述第一荧光基团的荧光颜色为红色或绿色或蓝色；

216、所述第二荧光基团的荧光颜色为红色或绿色或蓝色。

217、任选地，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和绿色形成的组合；或所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和蓝色形成的组合。

218、任选地，所述荧光颜色为绿色的荧光基团包括atto532、alexa fluor532、attorho6g或cy3；

219、所述荧光颜色为红色的荧光基团包括：atto647n、cy5、gm656或 alexa fluor647；

220、所述荧光颜色为蓝色的荧光基团包括：atto390、alexa fluor405或香豆素。

221、任选地，所述标记物包括n个荧光基团，其中，n为1或2。

222、任选地，所述特异性结合标记和所述偶配体的组合选自链霉亲和素（sa）-生物素（biotin）组合、生物素（biotin）-链霉亲和素组合（sa）、生物素（biotin）-抗生物素蛋白组合、抗体-抗原组合中的至少一种。

223、任选地，所述特异性结合标记和所述偶配体的组合选自生物素（biotin）-链霉亲和素（sa）组合。

224、下面为了方便理解和方便描述，以第一可切割基团为-n3-，第二可切割基团为二硫键-ss-为例，结合具体实施例对方案1进行说明。但应当理解的是，第一可切割基团和第二可切割基团的组合，不限于上述情形，可以选择本发明列举的其他可切割基团形成组合。另，本发明提供的核苷酸或其衍生物，可以为脱氧核糖核苷酸或其衍生物，也可以为核糖核苷酸或其衍生物。为了便于描述，下面示例统一以脱氧核糖核苷酸或其衍生物为例进行说明。其中，腺嘌呤脱氧核糖核苷酸或其衍生物由da表示、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸或其衍生物由dg表示、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸或其衍生物由dc表示、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸或其衍生物由dt表示。

225、本发明所述的双色测序的方案1中，示例性的，双色测序的步骤和信号情况可以如下表1所示情形1a：

226、表1.双色测序方法1a相适应的信号变化和检测步骤

227、

228、应当理解的是，可以将上表1提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

229、第一核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-ss-绿色荧光基团（或第二核苷酸或其衍生物-ss-绿色荧光基团），第三核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，和第四核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团。此时，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团。

230、示例性的，可实现如表1所示情形1a的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合1~组合4所示中的至少一种：

231、组合1：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

232、组合2：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

233、组合3：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

234、组合4：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532。

235、本发明所述的双色测序的方案1中，示例性的，双色测序的步骤和信号情况还可以如下表2所示情形1b：

236、表2.双色测序方法1b相适应的信号变化和检测步骤

237、

238、应当理解的是，可以将上表2提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

239、第一核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-ss-绿色荧光基团（或第二核苷酸或其衍生物-ss-绿色荧光基团），第三核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团-特异性结合标记，和第四核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团。此时，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团。

240、示例性的，可实现如表2所示情形1b的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合5~组合8所示中的至少一种：

241、组合5：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

242、组合6：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

243、组合7：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

244、组合8：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532。

245、本发明所述的双色测序的方案1中，示例性的，双色测序的步骤和信号情况可以如下表2所示情形1c：

246、表3. 双色测序方法1c相适应的信号变化和检测步骤

247、

248、应当理解的是，可以将上表3提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

249、第一核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-ss-红色荧光基团（或第二核苷酸或其衍生物-ss-红色荧光基团），第三核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，和第四核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团。此时，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团。

250、示例性的，可实现如表3所示情形1c的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合9或组合10所示中的至少一种：

251、组合9：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

252、组合10：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

253、本发明所述的双色测序的方案1中，示例性的，双色测序的步骤和信号情况可以如下表4所示情形1d：

254、表4.双色测序方法1d相适应的信号变化和检测步骤

255、

256、应当理解的是，可以将上表4提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

257、第一核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-ss-红色荧光基团（或第二核苷酸或其衍生物-ss-红色荧光基团），第三核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，和第四核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团。此时，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-红色荧光基团。

258、示例性的，可实现如表4所示情形1d的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合11或组合12所示中的至少一种：

259、组合11：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

260、组合12：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

261、本发明所述的双色测序的方案1中，示例性的，双色测序的步骤和信号情况可以如下表5所示情形1e：

262、表5.双色测序方法1e相适应的信号变化和检测步骤

263、

264、应当理解的是，可以将上表5提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

265、第一核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-ss-绿色荧光基团（或第二核苷酸或其衍生物-ss-绿色荧光基团），第三核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团-特异性结合标记，和第四核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团。此时，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团。

266、示例性的，可实现如表5所示情形1e的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合13或组合14所示中的至少一种：

267、组合13：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n -biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n；

268、组合14：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

269、作为实现本发明双色测序的另一种实现方式，所述组合1~14中，不具有特异性结合标记的种可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-的替换为-n3-ss-，不具有特异性结合标记的种可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-ss-替换为-n3-；和/或

270、所述组合1~14中，将-n3-ss-替换为-ss-。

271、在方案1的实施方式中，所述组合1~14中可进行荧光基团替换后形成新的情形。示例性的：

272、在一些实施方式中，所述组合1~14中，cy5和/或atto647n替换为gm656或 alexafluor647；和/或atto532和/或alexa fluor532替换为atto rho6g或cy3。

273、在另一些实施方式中，所述组合1~14中，cy5和/或atto647n替换为蓝光染料中的一种。

274、本发明所述的荧光基团替换，可发生在可切割基团替换前，也可以发生在可切割基团替换后，在可切割基团替换前后进行颜色替换后可形成新的适用于双色测序的可逆终止子组合用于检测。

275、本发明的具体实施例中，本发明所述的双色测序方法的方案1中，当可逆终止子为组合1时，各可逆终止子的使用浓度为：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n的使用浓度为10 nmol/l~700 nmol/l、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin/sa-cy3的使用浓度为5nmol/l~60 nmol/l、胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532  的使用浓度为10 nmol/l~700nmol/l 和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n的使用浓度为0.05 nmol/l~5 nmol/l。

276、方案2中，所述四种可逆终止子中的可切割基团相同，为第一可切割基团或第二可切割基团中的任意一种，此时本发明所述的双色测序方法，步骤四对所述延伸产物进行第二反应。

277、任选地，所述第一信号、所述第二信号、所述第三信号、所述第六信号和所述第七信号满足条件3)或条件4)，且四种可逆终止子的结构满足：

278、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-第一荧光基团；

279、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-特异性结合标记；或第二核苷酸或其衍生物-第一可切割集团或第二可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团-特异性结合标记；

280、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团特异性结合标记；或第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-第二荧光基团或第一荧光基团-特异性结合标记；

281、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-第二荧光基团；

282、其中，所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物中的一种，且所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物各不相同。

283、任选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自：atto532、atto647n、atto390、atto rho6g、alexa fluor405、alexa fluor532、gm656、alexafluor647、cy5、if700、rox、cy3、cy5罗丹明染料、花青染料、香豆素染料或枣红蛋白中的一种或多种形成的组合。

284、任选地，所述第一荧光基团的荧光颜色为红色或绿色或蓝色。

285、所述第二荧光基团的荧光颜色为红色或绿色或蓝色。

286、任选地，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和绿色形成的组合；或所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和蓝色形成的组合。

287、任选地，所述荧光颜色为绿色的荧光基团包括atto532、alexa fluor532、attorho6g或cy3。

288、所述荧光颜色为红色的荧光基团包括：atto647n、cy5、gm656或 alexa fluor647；

289、所述荧光颜色为蓝色的荧光基团包括：atto390、alexa fluor405或香豆素。

290、任选地，所述标记物包括n个荧光基团，其中，n为1或2；任选地，所述特异性结合标记和所述偶配体的组合选自链霉亲和素（sa）-生物素（biotin）组合、生物素（sa -链霉亲和素组合（sa）、生物素（sa -抗生物素蛋白组合、抗体-抗原组合中的至少一种。

291、任选地，所述特异性结合标记和所述偶配体的组合选自生物素-亲和素组合。

292、下面为了方便理解和方便描述，以第一可切割基团为-n3-为例，结合具体实施例对方案2进行说明。但应当理解的使，第一可切割基团也可以被第二可切割基团代替。第一可切割基团和第二可切割基团的组合，不限于上述情形，可以选择本发明列举的其他可切割基团。另，本发明提供的核苷酸或其衍生物，可以为脱氧核糖核苷酸或其衍生物，也可以为核糖核苷酸或其衍生物。为了便于描述，下面示例统一以脱氧核糖核苷酸或其衍生物为例进行说明。其中，腺嘌呤脱氧核糖核苷酸或其衍生物由da表示、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸或其衍生物由dg表示、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸或其衍生物由dc表示、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸或其衍生物由dt表示。

293、基于如上内容，本发明所述的双色测序的方案2中可具有不同的情形。在一种实现方式中，双色测序的步骤和信号情况可以如下表6所示情形2a：

294、表6.双色测序方法2a相适应的信号变化和检测步骤

295、

296、应当理解的是，可以将上表6提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

297、第一核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，第三核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团-特异性结合标记和第四核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团。

298、示例性的，可实现如表6所示情形2a的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合15或组合16所示中的至少一种：

299、组合15：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

300、组合16：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532。

301、在一种实现方式中，双色测序的步骤和信号情况还可以如下表7所示情形2b:

302、表7.双色测序方法2b相适应的信号变化和检测步骤

303、

304、应当理解的是，可以将上表7提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

305、第一核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，第三核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团-biotin和第四核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团。此时，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团，第四可逆终止子的标记物对应为：偶配体-红色荧光基团。

306、示例性的，可实现如表7所示情形2b的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合17~组合19所示中的至少一种：

307、组合17：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

308、组合18：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

309、组合19：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

310、在一种实现方式中，双色测序的步骤和信号情况还可以如下表8所示情形2c：

311、表8.双色测序方法2c相适应的信号变化和检测步骤

312、

313、应当理解的是，可以将上表8提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

314、第一核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，第三核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团-特异性结合标记和第四核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团。此时，第二可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团，第三可逆终止子的标记物对应为：偶配体-绿色荧光基团。

315、示例性的，可实现如表8所示情形2c的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合20或组合21所示中的至少一种：

316、组合20：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

317、组合21：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

318、在一种实现方式中，双色测序的步骤和信号情况还可以如下表9所示情形2d:

319、表9.双色测序方法2d相适应的信号变化和检测步骤

320、

321、应当理解的是，可以将上表9提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

322、第一核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，第三核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，和第四核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团。此时，第二可逆终止子的标记物对应为：偶配体-红色荧光基团。

323、示例性的，可实现如表9所示情形2d的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合22或组合23所示中的至少一种：

324、组合22：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

325、组合23：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532。

326、在一种实现方式中，双色测序的步骤和信号情况还可以如下表10所示情形2e:

327、表10. 双色测序方法2e相适应的信号变化和检测步骤

328、

329、应当理解的是，可以将上表10提供的可逆终止子中荧光基团的类型进行对调，此时，上述可逆终止子的组合也可以是下述情形：

330、第一核苷酸或其衍生物-n3-红色荧光基团，第二核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记，第三核苷酸或其衍生物-n3-特异性结合标记和第四核苷酸或其衍生物-n3-绿色荧光基团。此时，第二可逆终止子的标记物对应为：偶配体-红色荧光基团。

331、示例性的，可实现如表10所示情形2e的步骤和信号情况的可逆终止子的组合选自如下组合24或组合25所示中的至少一种：

332、组合24：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

333、组合25：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

334、在方案2的实施方式中，所述组合15~25中，可切割基团由-n3-替换为-ss-，可形成新的可逆终止子组合。

335、进一步的，在所述在上述组合15~25基础上，或组合15~25进行可切割基团替换的基础上，进行如下操作可形成新的可逆终止子组合：

336、在一些实施方式中所述组合15~25中，cy5和/或atto647n替换为gm656或 alexafluor647；和/或

337、atto532和/或alexa fluor532替换为atto rho6g或cy3；或

338、在另一些实施方式中所述组合15~25中，cy5和/或atto647n替换为蓝光染料中的一种。

339、本发明所述的方案2中，所述可逆终止子优选组合17。

340、所述组合17中，腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n的使用浓度为10 nmol/l~700 nmol/l、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin的使用浓度为5 nmol/l~60nmol/l、胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532的使用浓度为10 nmol/l~700 nmol/l和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-bitoin 0.05 nmol/l~5 nmol/l。

341、本发明所述方案1和方案2中，所述结合反应包括添加所述标记物；

342、任选地，所述结合反应的时间大于或等于20s。

343、本发明所述方案1和方案2中，所述切除第一可切除基团的切除试剂为有机磷切除试剂。

344、任选地，所述有机磷切除试剂中，有机磷选自三(3-羟丙基)膦、三(2-羧乙基)膦、三羟甲基膦、三苯基膦或三(2-羟乙基)膦中的任意一种或多种。

345、任选地，所述有机磷切除试剂中，有机磷为三(3-羟丙基)膦。

346、任选地，所述三(3-羟丙基)膦使用浓度为10 mmol/l~100 mmol/l。

347、本发明所述方案1和方案2中，所述切除第二可切除基团的切除试剂为还原剂。

348、任选地，所述还原剂中，所述还原剂选自dtt、谷胱甘肽和/或β-ss-乙醇。

349、任选地，所述还原剂为谷胱甘肽。

350、任选地，所述谷胱甘肽的使用浓度为10mmol/l~100mmol/l。

351、本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括四种可逆终止子、第一切割试剂和/或第二切割试剂；

352、所述四种可逆终止子独立的为：第一可逆终止子、第二可逆终止子、第三可逆终止子和第四可逆终止子；四种所述可逆终止子各自独立地包括：核苷酸或其衍生物，标记单元，以及连接所述核苷酸或其衍生物和所述标记单元的第一可切割基团和/或第二可切割基团，所述核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物；

353、其中，

354、所述标记单元选自：荧光基团和/或特异性结合标记，所述特异性结合标记用于与标记物结合，所述标记物包括偶配体和与所述偶配体结合的荧光基团；

355、当所述可逆终止子同时含有第一可切割基团和第二可切割基团时，所述第一可切割基团和所述第二可切割基团不同，所述第二可切割基团的可切割性强于所述第一可切割基团的可切割性；

356、所述第一切割试剂为切除第一可切割基团或第二可切割基团的试剂；

357、所述第二切割试剂为切除第一可切割基团或第二可切割基团的试剂。

358、任选地，所述切除第一可切除基团的切除试剂为有机磷切除试剂。

359、任选地，所述有机磷切除试剂中，有机磷选自三(3-羟丙基)膦、三(2-羧乙基)膦、三羟甲基膦、三苯基膦或三(2-羟乙基)膦中的任意一种或多种。

360、任选地，所述有机磷切除试剂中，有机磷为三(3-羟丙基)膦。

361、任选地，所述三(3-羟丙基)膦使用浓度为10 mmol/l~100 mmol/l。

362、任选地，所述切除第二可切除基团的切除试剂为还原剂。

363、任选地，所述还原剂中，所述还原剂选自dtt、谷胱甘肽和/或β-ss-乙醇。

364、任选地，所述还原剂为谷胱甘肽。

365、任选地，所述谷胱甘肽的使用浓度为10 mmol/l~100 mmol/l。

366、进一步的，本发明所述的试剂盒中，所述四种可逆终止子中的一个或多个含有所述第一可切割基团，且所述四种可逆终止子中的一个或多个含有所述第二可切割基团。

367、任选地，

368、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团，

369、所述第二可逆终止子的结构为如下情形的一种：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团；或第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；或第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团-特异性结合标记；

370、所述第三可逆终止子的结构为如下情形的一种：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团；或第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-特异性结合标记；或第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团-特异性结合标记；

371、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团-第二荧光基团；

372、所述第二可逆终止子和所述第三可逆终止子不同时含有特异性结合标记；

373、或

374、所述四种可逆终止子中的可切割基团相同，为第一可切割基团或第二可切割基团中的任意一种；

375、所述第一可逆终止子的结构为：第一核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-第一荧光基团；

376、所述第二可逆终止子的结构为：第二核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-特异性结合标记；或第二核苷酸或其衍生物-第一可切割集团或第二可切割基团-第一荧光基团或第二荧光基团-特异性结合标记；

377、所述第三可逆终止子的结构为：第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团特异性结合标记；或第三核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-第二荧光基团或第一荧光基团-特异性结合标记；

378、所述第四可逆终止子的结构为：第四核苷酸或其衍生物-第一可切割基团或第二可切割基团-第二荧光基团；

379、其中，

380、所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物选自腺嘌呤或其衍生物、胸腺嘧啶或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物或鸟嘌呤或其衍生物中的一种，且所述第一核苷酸或其衍生物、所述第二核苷酸或其衍生物、所述第三核苷酸或其衍生物和所述第四核苷酸或其衍生物各不相同。

381、任选地，所述第一可切割基团选自包含-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6和/或-arc6、二硫键中的至少一种的基团。

382、任选地，所述第一可切割基团选自-n3-、-ch2f、-c(o)nhbu、-chf2、-c(o)oh、-c6和/或-arc6、二硫键中的至少一种。

383、任选地，所述第一可切割基团为-n3-或二硫键。

384、任选地，所述第二可切割基团选自包含二硫键的基团。

385、任选地，所述第二可切割基团为二硫键（-ss-）。

386、任选地，所述荧光基团选自颜色可区分的第一荧光基团和第二荧光基团。

387、任选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团各自独立地选自：atto532、atto647n、atto390、atto rho6g、alexa fluor405、alexa fluor532、gm656、alexafluor647、cy5、if700、rox、cy3、cy5罗丹明染料、花青染料、香豆素染料或枣红蛋白中的一种或多种形成的组合。

388、任选地，所述第一荧光基团的荧光颜色为红色或绿色或蓝色。

389、所述第二荧光基团的荧光颜色为红色或绿色或蓝色。

390、任选地，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和绿色形成的组合；或所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的组合为红色和蓝色形成的组合。

391、任选地，所述荧光颜色为绿色的荧光基团包括atto532、alexa fluor532、attorho6g或cy3；

392、所述荧光颜色为红色的荧光基团包括：atto647n、cy5、gm656或 alexa fluor647；

393、所述荧光颜色为蓝色的荧光基团包括：atto390、alexa fluor405或香豆素。

394、任选地，所述标记物包括n个荧光基团，其中，n为1或2。

395、任选地，所述特异性结合标记和所述偶配体的组合选自生物素（biotin）-链霉亲和素（sa）组合、生物素（biotin）-链霉亲和素（sa）组合、生物素-抗生物素蛋白组合、抗体-抗原组合中的至少一种。

396、任选地，所述特异性结合标记和所述偶配体的组合选自生物素（biotin）-链霉亲和素（sa）组合。

397、更进一步的，本发明所述的试剂盒中，

398、所述可逆终止子包括如下组合1~15中的至少一种，或组合15~25中的至少一种

399、组合1：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

400、组合2：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

401、组合3：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

402、组合4：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

403、组合5：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

404、组合6：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

405、组合7：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3- cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

406、组合8：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-cy5、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

407、组合9：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

408、组合10：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

409、组合11：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

410、组合12：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5；

411、组合13：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n -biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3- atto647n；

412、组合14：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss- atto532、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

413、组合15：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

414、组合16：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

415、组合17：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

416、组合18：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-cy5、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

417、组合19：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

418、组合20：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

419、组合21：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

420、组合22：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

421、组合23：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532；

422、组合24：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto647n；

423、组合25：腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto532、鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-biotin、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin和胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-cy5。

424、任选地，本发明所述试剂盒的所述的组合中，进行如下可切割基团的替换可形成新的组合：

425、所述组合1~14中，所述组合1~14中，不具有特异性结合标记的种可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-的替换为-n3-ss-，不具有特异性结合标记的种可逆终止子中的任意一种中的可切割基团-n3-ss-替换为-n3-；和/或

426、所述组合1~14中，与胞嘧啶核苷酸或其衍生物相连的-n3-替换为-n3-ss-，且与鸟嘌呤核苷酸或其衍生物相连的-n3-ss-替换为-n3-；

427、或，所述组合15~25中，可切割基团由-n3-替换为-ss-。

428、更进一步的，在组合1~25的基础上，或，在组合1~25进行可切割基团替换后进行如下替换会形成新的组合：

429、所述组合1~25中，cy5和/或atto647n替换为gm656或 alexa fluor647；和/或

430、atto532和/或alexa fluor532替换为atto rho6g或cy3；或

431、所述组合1~25中，cy5和/或atto647n替换为蓝光染料中的一种。

432、本发明所述的试剂盒中，所述组合优选组合1，所述组合1中，腺嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-atto647n的使用浓度为10 nmol/l~700 nmol/l、胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-biotin/sa-cy3的使用浓度为5 nmol/l~60 nmol/l、胞嘧啶核苷酸或其衍生物-n3-atto532的使用浓度为10 nmol/l~700 nmol/l 和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物-n3-ss-atto647n的使用浓度为0.05 nmol/l~5 nmol/l。

433、本发明中，所述双色测序方法的可逆终止子的种类与所述双色测序方法的具体的步骤相适应，改变可逆终止子的种类，则测序可能不能实现；同时本发明对本发明通过可逆终止子浓度的优化、第一可切割试剂和第二可切割试剂浓度的优化，曝光时间、波长的优化等，获得了适用本发明所述的可逆终止子体系下的单分子测序的双色测序方法。

434、本发明通过对所述双色测序方法参与反应的可逆终止子进行合理的设计，并对参与所述双色测序方法的试剂和反应条件进行了优化，获得了适合单分子测序平台的双色测序方法，所述双色测序方法用于单分子测序中，有助于降低错误率，改善测序质量，缩短测序时长。