由HLA-DQ呈递的RAS突变体及与其结合的抗原结合蛋白的制作方法

本发明涉及蛋白质和细胞免疫领域。具体地，本发明涉及能够结合由hla-dq呈递的ras突变体的抗原结合蛋白例如t细胞受体（tcr），编码tcr的分离的核酸分子，表达所述tcr的细胞，以及其制备方法和用途。

背景技术：

1、大鼠肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，ras)是一种原癌基因，具有gtp酶活性，参与众多调节细胞增殖、分化和凋亡相关的信号通路，例如mapk、pi3k、stat信号通路等。1982年der cj等人首次证实了ras基因突变是癌症发生驱动因素。人类基因中有3种编码ras基因，分别是hras（geneid：3265）、nras（geneid：4893）和kras（geneid：3845），三种ras基因具有高度的序列同源性（>90%）。人类肿瘤中约有33%携带ras基因突变，ras基因突变也成为发生频率最高的原癌基因突变。人类肿瘤中ras基因突变发生最高的为kras约占22%，nras约占8.0%，hras约占3.3%。

2、kras基因突变在实体瘤中发生率最高（约占三种ras突变的86%），例如，结直肠癌（50%）、胰腺癌（85%）及非小细胞肺癌（20%），超过90%突变集中发生在exon2和exon3，其中常见的突变体有g12v、g12d和g13d等。相比kras野生型肿瘤患者，具有kras突变的患者无进展生存期和总生存期较短，术后复发和转移的可能性更高。ras突变的患者有更高的肿瘤复发、耐药、更差的预后和总生存期，这些患者群体亟需新的治疗方法。

3、肿瘤内的ras突变蛋白可经溶酶体或蛋白酶体途径产生短肽（8-16个氨基酸），并经由运输途径（例如tap）至内质网，与主要组织相容性复合体（mhc）形成pmhc复合体，表达于肿瘤细胞表面。ras突变抗原肽与mhc形成的pmhc复合体仅表达于ras突变阳性的肿瘤细胞，而不表达于健康组织，因此形成了理想的免疫疗法靶点。t细胞受体（tcr）是表达于t细胞表面的跨膜蛋白，由tcrα和tcrβ组成，多样性极高，可达到1014-16种；tcr可特异性结合pmhc复合体，并激活t细胞诱导肿瘤杀伤。利用转基因技术或蛋白质工程可制备tcr基因转导的t细胞或t细胞衔接器类药物，应用于pmhc复合体阳性疾病的治疗。

4、hla-dq是一种ii型mhc分子，由hla-dqa1和dqb1组成。hla-dqa1等位基因数量超过1000种，常见的dqa1等位基因有dqa1*01、dqa1*02和dqa1*05；hla-dqb1等位基因数量超过3000种，常见的dqb1等位基因有dqb1*03、dqb1*05和dqb1*06，因此hla-dq组合多样性较高。然而在世界各国人种中，常发现固定的dqa1和dqb1组合，例如dqa1*03:02-dqb1*03:03在亚洲呈现较高频率（>30%）；dqa1*01-dqb1*05则在全球人种较为广泛分布，频率>20%。在接受免疫检查点抑制剂治疗的乳腺癌和黑色素瘤患者中，分析发现mhc-ii表达（hla-dr/dp/dq）与患者响应有关，mhc-ii阳性患者获得完全响应和肿瘤缓解显著高于mhc-ii阴性患者，表明mhc-ii限制性t细胞克隆，参与了抗肿瘤作用（

laura esserman, jco, 2019; barbara

hegyi, biomolecules, 2024）。

5、因此，需要开发新的tcr蛋白药物和细胞免疫疗法，为患者提供新的治疗选择。

技术实现思路

1、本公开提供了能特异性结合由mhc分子呈递的具有g12v取代的ras蛋白抗原肽的tcr或其抗原结合部分以及包含tcr或其抗原结合部分的蛋白（又称为抗原结合蛋白）。所述t细胞受体能特异性识别由包含g12v突变的ras抗原肽与hla-dq形成的pmhc复合体。这种t细胞受体或其抗原结合片段可进一步开发为特定药物形式，用于治疗具有rasg12v突变的肿瘤。

2、在一方面，本公开提供了一种tcr或其抗原结合部分，其能够特异性结合与mhc-ii类分子复合的具有g12v取代的ras蛋白抗原肽，所述mhc-ii类分子选自hla-dqa1*01/dqb1*05和hla-dqa1*03/dqb1*03。在一些实施方案中，具有g12v取代的ras蛋白抗原肽包含seqid no: 31或34的氨基酸序列。在一些实施方案中，hla-dqa1*01包含dqa1*01:01、dqa1*01:02和dqa1*01:03，hla-dqb1*05包含dqb1*05:01、dqb1*05:02和dqb1*05:03。在一些实施方案中，hla-dqa1*03包含dqa1*03:01、dqa1*03:02和dqa1*03:03，hla-dqb1*03包含dqb1*03:01、dqb1*03:02和dqb1*03:03。

3、在一些实施方案中，所述tcr或其抗原结合部分包含α链可变区（vα）和β链可变区（vβ），其中所述vα包含cdr1α、cdr2α和cdr3α，所述vβ包含cdr1β、cdr2β和cdr3β，其中：

4、(a)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 1、2和3所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 4、5和6所示的氨基酸序列；

5、(b)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 7、8和9所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 10、11和12所示的氨基酸序列；或

6、(c)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 13、14和15所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 16、17和18所示的氨基酸序列。

7、在一些实施方案中，在所述tcr或其抗原结合部分中：

8、(a)所述vα包含与seq id no: 19具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，和所述vβ包含与seq id no: 20具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列；

9、(b)所述vα包含与seq id no: 21具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，和所述vβ包含与seq id no: 22具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列；或

10、(c)所述vα包含与seq id no: 23具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，和所述vβ包含与seq id no: 24具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。

11、在一些进一步的实施方案中，其中：

12、(a)所述vα包含seq id no: 19所示的序列和所述vβ包含seq id no: 20所示的序列；

13、(b)所述vα包含seq id no: 21所示的序列和所述vβ包含seq id no: 22所示的序列；或

14、(c)所述vα包含seq id no: 23所示的序列和所述vβ包含seq id no: 24所示的序列。

15、在一些实施方案中，所述具有g12v取代的ras蛋白抗原肽是具有g12v取代的kras蛋白、nras蛋白或hras蛋白的抗原肽。

16、在一些实施方案中，所述具有g12v取代的ras蛋白抗原肽包含seq id no: 26的氨基酸序列或其片段，所述片段包含seq id no: 31或34的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述ras抗原肽选自seq id no: 31、40-41和43-46。在一些实施方案中，所述ras抗原肽选自seq id no: 28、34、37-38、40-41和43-46。

17、在一些实施方案中，所述tcr或其抗原结合部分还包含α链恒定区（cα）和β链恒定区（cβ）。

18、在一些实施方案中，所述tcr或其抗原结合部分是可溶性tcr或单链tcr。

19、在一方面，本公开提供了一种分离的或重组蛋白，其包含本文公开的tcr或其抗原结合部分。

20、在一方面，本公开提供了一种分离的或重组蛋白，其包含tcr的抗原结合部分，所述tcr的抗原结合部分能够特异性结合ras蛋白抗原肽与mhc-ii类分子的复合体，所述mhc-ii类分子选自hla-dqa1*01/dqb1*05和hla-dqa1*03/dqb1*03。在一些实施方案中，所述ras蛋白抗原肽具有seq id no: 31或34的氨基酸序列。

21、在一些实施方案中，所述tcr的抗原结合部分包含α链可变区（vα）和β链可变区（vβ），其中所述vα包含cdr1α、cdr2α和cdr3α，所述vβ包含cdr1β、cdr2β和cdr3β，其中：

22、(a)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 1、2和3所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 4、5和6所示的氨基酸序列；

23、(b)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 7、8和9所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 10、11和12所示的氨基酸序列；或

24、(c)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 13、14和15所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 16、17和18所示的氨基酸序列。

25、在一方面，本公开提供了一种分离的或重组蛋白，其能够特异性结合ras蛋白抗原肽与mhc-ii类分子的复合体，所述mhc-ii类分子选自hla-dqa1*01/dqb1*05和hla-dqa1*03/dqb1*03。在一些实施方案中，所述ras蛋白抗原肽具有seq id no: 31或34的氨基酸序列。

26、在一些实施方案中，所述分离的或重组蛋白包含tcr α链序列和tcr β链序列，其中所述tcr α链序列包含cdr1α、cdr2α和cdr3α，所述tcr β链序列包含cdr1β、cdr2β和cdr3β，其中：

27、(a)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 1、2和3所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 4、5和6所示的氨基酸序列；

28、(b)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 7、8和9所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 10、11和12所示的氨基酸序列；或

29、(c)所述cdr1α、cdr2α和cdr3α分别包含如seq id no: 13、14和15所示的氨基酸序列，所述cdr1β、cdr2β和cdr3β分别包含如seq id no: 16、17和18所示的氨基酸序列。

30、在一些实施方案中，所述分离的或重组蛋白包含α链可变区（vα）和β链可变区（vβ），其中：

31、(a)所述vα包含与seq id no: 19具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，和所述vβ包含与seq id no: 20具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列；

32、(b)所述vα包含与seq id no: 21具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，和所述vβ包含与seq id no: 22具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列；或

33、(c)所述vα包含与seq id no: 23具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，和所述vβ包含与seq id no: 24具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。

34、在一方面，本公开提供了ras蛋白抗原肽与mhc-ii类分子的复合体，所述mhc-ii类分子为hla-dqa1*01/dqb1*05或hla-dqa1*03/dqb1*03，所述ras蛋白抗原肽具有seq idno: 31或34的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述具有seq id no: 31或34的氨基酸序列的ras蛋白抗原肽是seq id no: 26的片段。在一些实施方案中，所述ras抗原肽选自seq idno: 31、40-41和43-46。在一些实施方案中，所述ras抗原肽选自seq id no: 28、34、37-38、40-41和43-46。

35、在一方面，本公开提供了一种ras蛋白抗原肽，其包含seq id no: 31或34的氨基酸序列或由其组成。

36、在一方面，本公开提供了一种核酸，其包含编码所述tcr或其抗原结合部分或所述分离的或重组蛋白的α链可变区（vα）和β链可变区（vβ）的核苷酸序列。

37、在一些实施方案中，所述核酸包含编码所述tcr或其抗原结合部分或所述分离的或重组蛋白的核苷酸序列。

38、在一方面，本公开提供了一种载体，其包含本文公开的核酸。

39、在一些实施方案中，所述载体是质粒、病毒载体、噬菌体、转座子、粘粒、纳米颗粒或脂质体。

40、在一方面，本公开提供了一种工程化的免疫细胞，其包含本文公开的核酸或载体。

41、在一些实施方案中，所述免疫细胞是t细胞或nk细胞。

42、在一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本文公开的核酸或载体。任选地，所述宿主细胞用于产生本公开的tcr或其抗原结合部分或所述分离的或重组蛋白。

43、在一方面，本公开提供了一种抗原结合蛋白，其能够特异性结合与mhc分子复合的具有g12v取代的ras蛋白抗原肽，所述抗原结合蛋白包含α链可变区（vα）和β链可变区（vβ），其中所述vα包含cdr1α、cdr2α和cdr3α，所述vβ包含cdr1β、cdr2β和cdr3β，如下文表2所列出的。

44、在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含本文公开的tcr或其抗原结合部分。

45、在一方面，本公开提供了一种缀合物，其包含本文公开的tcr或其抗原结合部分或分离的蛋白或重组蛋白缀合于效应子部分，所述效应子部分选自细胞毒性剂和核素。

46、在一些实施方案中，所述细胞毒性剂选自烷化剂、微管抑制剂、抗癌性抗生素和抗代谢剂。

47、在一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文公开的tcr或其抗原结合部分、分离的或重组蛋白、核酸、载体、工程化的免疫细胞、抗原结合蛋白或者缀合物，以及药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

48、在一方面，本公开提供了在受试者中诱导针对具有ras g12v突变的肿瘤的免疫应答和/或在受试者中预防或治疗具有ras g12v突变的肿瘤的方法，其包括向受试者施用本文公开的tcr或其抗原结合部分、分离的或重组蛋白、核酸、载体、工程化的免疫细胞、抗原结合蛋白、缀合物、或药物组合物。

49、在一方面，本公开提供了本文公开的tcr或其抗原结合部分、分离的或重组蛋白、核酸、载体、工程化的免疫细胞、抗原结合蛋白、缀合物、或药物组合物用于在受试者中诱导针对具有ras g12v突变的肿瘤的免疫应答和/或在受试者中预防或治疗具有ras g12v突变的肿瘤。

50、在一方面，本公开提供了本文公开的tcr或其抗原结合部分、分离的或重组蛋白、核酸、载体、工程化的免疫细胞、抗原结合蛋白、缀合物、或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对具有ras g12v突变的肿瘤的免疫应答和/或在受试者中预防或治疗具有ras g12v突变的肿瘤。

51、在一些实施方案中，所述具有ras g12v突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、胆管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤。

52、在一些实施方案中，所述受试者的hla包含hla-dqa1*01/dqb1*05或hla-dqa1*03/dqb1*03。在一些实施方案中，hla-dqa1包含dqa1*01:01、dqa1*01:02和dqa1*01:03，hla-dqb1包含dqb1*05:01、dqb1*05:02和dqb1*05:03。在一些实施方案中，hla-dqa1包含dqa1*03:01、dqa1*03:02和dqa1*03:03，hla-dqb1包含dqb1*03:01、dqb1*03:02和dqb1*03:03。

53、在一些实施方案中，所述治疗还包括用另外的治疗剂治疗受试者，所述另外的治疗剂选自免疫检查点抑制剂、化疗药物、放疗增敏剂、细胞因子和抗体。