一种高效生产2-吡咯烷酮的重组谷氨酸棒状杆菌及其应用

本发明涉及一种高效生产2-吡咯烷酮的重组谷氨酸棒状杆菌及其应用，属于生物工程。

背景技术：

1、2-吡咯烷酮（2-pyrrolidone）是结构简单的环状内酰胺类化合物，相对分子质量85.10，分子式为c4h7no。2-吡咯烷酮分子同时含有高活性酰胺环与亚甲基烷基结构，兼具优异的极性溶解能力、生物相容性与可聚合特性，使其在绿色有机溶剂、生物基可降解高分子、医药中间体、农药助剂、锂电池电解液、水处理螯合剂等领域具备极高应用价值。当前工业端2-吡咯烷酮主要用于高端萃取溶剂、聚吡咯烷酮单体、药物合成原料；此外，还可作为纺织匀染剂、催化剂载体、电子清洗剂、树脂改性配料，广泛配套精细化工、生物医药与新能源行业。随着生物基材料、绿色制造产业快速发展，新工艺持续迭代放大，2-吡咯烷酮下游应用场景逐年拓宽，国内市场需求持续攀升。

2、受传统化学合成路线产能与产品品质制约，国内2-吡咯烷酮行业市场集中度较高。现有工业化制备以化学法为主，依托丁内酯与液氨高温高压催化合成。但传统化学合成工艺存在显著短板：反应需高温高压苛刻工况，设备投资与能耗成本高；反应副产物多、分离提纯流程冗长；原料依赖化石基丁内酯，碳排高且不符合生物制造发展趋势；高纯度食品级、医药级2-吡咯烷酮产能缺口大，高纯固体产品高度依赖海外进口。因此，开发温和、低碳、高选择性的微生物发酵合成路线成为行业发展刚需。

3、近年来，国内外代谢工程领域针对微生物合成2-吡咯烷酮开展了大量系统性研究，谷氨酸棒杆菌（

corynebacterium glutamicum）因发酵工艺成熟、食品安全级底盘、工业放大适配性强等优势，成为生产 2-吡咯烷酮最主流的工程菌株。现有研究中，邓禹团队以

c. glutamicummg1655 为出发底盘，通过理性代谢改造、中心碳代谢模块重构强化 gaba前体供给，耦合外源 coa 转移酶催化通路，最终 2-吡咯烷酮发酵产量达 62.5 g/l；张学礼等人以

c. glutamicumatcc 8739 为宿主，搭建乙酸利用旁路补充胞内乙酰-coa，平衡前体 gaba 与辅酶供给，目标产物产量提升至 70.2 g/l。

4、然而，上述高产菌株均依赖依赖 iptg 化学诱导剂，iptg 价格昂贵、无法完全降解，不仅显著拉高发酵原料成本，还会增加产物后处理提纯难度，严重限制菌株规模化工业应用。因此，构建一株无需iptg诱导的稳定型谷氨酸棒杆菌工程菌，实现低成本、高稳定发酵合成2-吡咯烷酮，是本领域亟待解决的关键技术难题。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明提供一株高产2-吡咯烷酮的谷氨酸棒状杆菌工程菌，以及应用该工程菌生产2-吡咯烷酮的方法。本发明通过在谷氨酸棒状杆菌细胞中敲除副产物路径基因，并在基因组中过量表达2-吡咯烷酮合成途径中的关键酶（谷氨酸脱羧酶

ecgad

、肉碱辅酶a连接酶

eccaic）以及提高胞内辅因子含量（丙酮酸脱氢酶e1亚基

acee、电子传递链细胞色素bc1复合体

qcrabc）与gaba含量（γ-氨基丁酸内转运蛋白

gadp）的相关基因，实现了2-吡咯烷酮的高效生产，为2-吡咯烷酮的工业化生产奠定了基础。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一个目的是提供一种高效生产2-吡咯烷酮的重组谷氨酸棒状杆菌，所述重组谷氨酸棒状杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主中，敲除或弱化了乙酰乳酸合酶编码基因

pqo、磷酸乙酰转移酶编码基因

pta、乙酸激酶编码基因

acka、乳酸脱氢酶编码基因

ldha、琥珀酸半醛脱氢酶编码基因

gabd，并过表达了肉碱辅酶a连接酶编码基因

eccaic、谷氨酸脱羧酶编码基因

ecgad

、丙酮酸脱氢酶e1亚基编码基因

acee、γ-氨基丁酸内转运蛋白编码基因

gadp、电子传递链细胞色素bc1复合体编码基因

qcrabc。

4、在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将各个编码基因在基因组上进行表达。

5、在本发明的一种实施方式中，肉碱辅酶a连接酶编码基因

eccaic在

pqo位点进行表达、谷氨酸脱羧酶编码基因

ecgad在

pta位点进行表达

、丙酮酸脱氢酶e1亚基编码基因

acee在

acka位点进行表达

、γ-氨基丁酸内转运蛋白编码基因

gadp在

ldha位点进行表达

、电子传递链细胞色素bc1复合体编码基因

qcrabc在

gabd位点进行表达。

6、在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒状杆菌还包括采用质粒过表达2拷贝数肉碱辅酶a连接酶编码基因

eccaic和1拷贝数谷氨酸脱羧酶编码基因

ecgad。

7、在本发明的一种实施方式中，所述质粒为谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pzk，该质粒是以pcrb12为骨架，插入para-parb-pars 质粒分配系统，并插入

gapa 、tuf强组成型启动子和大肠杆菌rrnb t1-t2双终止子构成的表达单元。

8、在本发明的一种实施方式中，所述肉碱辅酶a连接酶

eccaic核苷酸序列如seq idno.1所示，所述谷氨酸脱羧酶

ecgad的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述丙酮酸脱氢酶e1亚基

acee的核苷酸序列如seq id no.3，所述γ-氨基丁酸内转运蛋白

gadp的核苷酸序列如seq id no.4，所述电子传递链细胞色素bc1复合体

qcrabc的核苷酸序列如seq id no.5。

9、在本发明的一种实施方式中，所述肉碱辅酶a连接酶

eccaic是以核苷酸序列如seqid no.6或seq id no.7所示的启动子启动表达，所述谷氨酸脱羧酶

ecgad是以核苷酸序列如seq id no.7所示的启动子启动表达。

10、在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌宿主为

corynebacterium

glutamicums9114。

11、本发明的第二个目的是提供所述重组谷氨酸棒状杆菌在生产2-吡咯烷酮中的应用。

12、在本发明的一种实施方式中，所述应用是采用所述重组谷氨酸棒状杆菌，以葡萄糖为底物，发酵生产2-吡咯烷酮。

13、在本发明的一种实施方式中，发酵时，发酵培养基组成为：6~10 g/l 酵母粉，40~60 g/l 硫酸铵，0.4~0.6 g/l 三水磷酸氢二钾，0.8~1.2 g/l 磷酸二氢钾，30~50 g/l 葡萄糖，0.01~0.03 g/l 一水硫酸锰，0.4~0.6 g/l 磷酸氢二钠，2.4~2.6 g/l 七水硫酸镁，70~90 mg/l 生物素，2~4 mm plp。

14、本发明的有益效果：

15、本发明构建的重组谷氨酸棒状杆菌能够以葡萄糖为底物，在质粒水平，短时间内获得较高的2-吡咯烷酮。该菌株发酵过程操作便捷，摇瓶发酵时，48h的产量达到8.55 g/l；在5 l发酵罐中，发酵72 h的产量可达75.7 g/l，生产强度为1.05 g/l/h。