一种酶介导错配切割的鲫疱疹病毒荧光检测方法及试剂盒

本发明涉及水产动物病原核酸检测，具体涉及一种酶介导错配切割的鲫疱疹病毒荧光检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、鲫疱疹病毒（carassius auratus herpesvirus，cahv）是一种能够感染鲫、金鱼等鲤科鱼类的双链dna病毒。感染鱼在感染初期或病毒载量较低时可能缺乏典型外观症状，但其携带的病毒可通过水体接触、苗种运输等途径传播。当养殖水温、水质、养殖密度等环境条件发生变化时，感染鱼可能出现出血、鳃组织损伤及内脏病变等症状，对鲫鱼和金鱼的苗种繁育及规模化养殖造成不利影响。因此，对养殖鱼类离体组织及养殖水体样品中的cahv核酸进行快速检测，对水产病原监测具有重要意义。

2、目前，cahv的检测方法主要包括病毒分离、免疫学检测、聚合酶链式反应和等温核酸扩增等。病毒分离所需时间较长，对实验条件和操作人员要求较高；胶体金试纸等免疫学检测方法操作方便，但在样品中病原含量较低时，检测灵敏度可能受到限制。pcr和实时荧光定量pcr能够对病毒核酸进行检测，但通常需要进行核酸提取和纯化，并依赖具有多段温度循环功能的扩增设备及配套实验条件，现场应用受到一定限制。因此，需要进一步提高水产养殖现场对cahv核酸进行快速检测的便利性。

3、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa）能够在相对较低且基本恒定的温度下进行核酸扩增，不需要传统pcr的反复升温和降温过程，具有反应时间较短、设备要求较低等特点。现有rpa检测通常采用正向引物和反向引物浓度相同的对称扩增方式，扩增产物以双链dna为主。在采用核酸探针进行后续检测时，扩增产物的两条互补链容易重新结合，并可能与探针杂交形成竞争，从而影响探针对目标链的结合效率，特别是在模板核酸含量较低时，可能导致检测信号不足。此外，不同鱼类疱疹病毒的部分基因区域具有一定序列相似性，仅依靠扩增引物或普通探针进行单一层级识别，可能产生非特异性扩增或非目标核酸杂交信号，影响检测结果的准确性。

4、鲫鱼鳃、肝、脾、肾、全血以及养殖水体沉淀等样品中可能含有黏液、蛋白质、多糖、腐殖酸及其他影响核酸扩增的物质。采用硅胶柱或磁珠等方式进行核酸纯化虽然能够提高核酸纯度，但会增加样品前处理步骤和检测时间。部分核酸扩增终点检测方法还需要将扩增产物转移至其他反应容器，或者在扩增后开盖加入显色试剂，增加了操作复杂程度和扩增产物污染的风险。因此，现有技术仍需要一种能够适应离体鱼组织和养殖水体样品、简化核酸前处理、在较低恒定温度下完成扩增，并能够提高目标单链利用率和核酸识别特异性的cahv荧光检测方法。

技术实现思路

1、针对现有cahv核酸检测过程中存在的样品前处理步骤较多、检测设备要求较高、低含量目标核酸检测信号不足以及近缘病原核酸可能产生非特异性信号等问题，本发明提供一种酶介导错配切割的鲫疱疹病毒荧光检测方法及试剂盒。该方法以离体鲫鱼组织、全血或养殖水体沉淀样品的核酸粗提液为模板，在条件下，采用正向引物与反向引物终浓度比为1∶10的非对称重组酶聚合酶扩增体系，以增加可供荧光探针结合的目标单链；扩增完成后，在同一反应管内加入含连续双碱基错配的荧光探针、错配内切酶及酶切缓冲液，使所述荧光探针与cahv orf66目标单链形成错配异源双链并经酶促错配切割（enzyme mismatch cleavage，emc）产生荧光信号。该技术方案能够减少核酸纯化和扩增产物转移步骤，降低操作复杂程度及扩增产物污染风险，并有利于提高低含量目标核酸的检测信号以及降低近缘病原核酸引起的非特异性信号。

2、为达成上述目的，本技术具体提出如下技术方案一种用于检测离体样品中鲫疱疹病毒核酸的体外荧光检测方法，包括以下步骤：

3、（1）将离体的鲫鱼组织、全血或养殖水体沉淀样品快速匀浆后与核酸粗提缓冲液混合，经裂解、离心后取上清液，得到核酸粗提液；

4、（2）以所述核酸粗提液为模板，采用靶向鲫疱疹病毒orf66基因的正向引物和反向引物进行非对称重组酶聚合酶扩增，其中，正向引物与反向引物的终浓度之比为1∶10，扩增温度为，扩增时间为20 min；

5、（3）向扩增产物所在的同一反应容器中加入荧光探针和错配内切酶，所述荧光探针的5′端修饰有fam荧光报告基团，3′端修饰有bhq1淬灭基团，且所述荧光探针中设置有两个连续的错配碱基；所述荧光探针与鲫疱疹病毒orf66基因的目标单链杂交形成含连续双碱基错配的异源双链，并由所述错配内切酶切割产生荧光信号；

6、（4）采用激发波长为495 nm、发射波长为520 nm的荧光检测装置采集荧光信号，根据所述荧光信号判断离体样品中是否含有鲫疱疹病毒orf66目标核酸。

7、优选地，所述正向引物的核苷酸序列为：

8、5′-atggacgagtttatggacagcgtcgccaag-3′；

9、所述反向引物的核苷酸序列为：

10、5′-gcagtcctgtccgcggccagtaatatagcg-3′；

11、所述正向引物的终浓度为0.05～0.2 μmol/l，所述反向引物的终浓度为所述正向引物终浓度的10倍。

12、优选地，所述荧光探针的核苷酸序列为：

13、5′-agacgcaaagaattatacgagct-3′；

14、其中，以所述荧光探针的5′端为起点，所述荧光探针的第15位碱基和第16位碱基分别为a和t，鲫疱疹病毒orf66目标序列相应位置的碱基分别为c和a，由此形成连续双碱基错配；所述荧光探针完全互补序列理论tm值为50 ℃，采用page纯化。

15、优选地，所述错配内切酶选自t4核酸内切酶ⅶ，t7核酸内切酶ⅰ以及cel ⅰ核酸酶中的至少一种；所述荧光探针、错配内切酶和含的酶切缓冲液同时加入非对称rpa产物中，于39 ℃孵育20 min，使荧光探针杂交与emc在同一反应体系中进行。

16、优选地，一种鲫疱疹病毒核酸荧光检测试剂盒，包括：

17、（1）核酸粗提缓冲液；

18、（2）非对称重组酶聚合酶扩增预混液，所述扩增预混液含有重组酶、聚合酶、辅助蛋白和缓冲盐；

19、（3）正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列为：

20、5′-atggacgagtttatggacagcgtcgccaag-3′；

21、所述反向引物的核苷酸序列为：

22、5′-gcagtcctgtccgcggccagtaatatagcg-3′；

23、（4）荧光探针，所述荧光探针的核苷酸序列为：

24、5′-agacgcaaagaattatacgagct-3′；

25、所述荧光探针的5′端修饰有fam荧光报告基团，3′端修饰有bhq1淬灭基团，且第15位碱基和第16位碱基构成相对于鲫疱疹病毒orf66目标序列的连续双碱基错配；

26、（5）错配内切酶及其酶切缓冲液；

27、（6）阴性对照和含鲫疱疹病毒orf66目标序列的阳性对照。

28、优选地，所述核酸粗提缓冲液含有3 mol/l乙酸钾、10 mmol/l乙二胺四乙酸二钠二水合物、0.5 mol/l氢氧化钠和8.7 mmol/l三（2-羧乙基）膦盐酸盐；所述错配内切酶为t4核酸内切酶ⅶ；所述酶切缓冲液含有50 mm tris-hcl(ph 8.0)、10 mm 、100 mmnacl和1 mm 二硫苏糖醇；所述阴性对照为pet-28a(+)质粒，所述阳性对照为含鲫疱疹病毒orf66目标序列的pet-28a(+)-cahv-orf66质粒。

29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

30、1.本发明采用正向引物与反向引物终浓度比为1∶10的非对称rpa扩增体系，使扩增反应产生较多可供荧光探针结合的目标单链，减少互补链重新结合对探针杂交的影响，有利于提高目标核酸的荧光检测信号。

31、2.本发明在荧光探针中设置连续双碱基错配位点，并利用错配内切酶对探针与cahv orf66目标单链形成的错配异源双链进行切割，形成由引物扩增、探针杂交和错配酶切组成的多级核酸识别过程。在所测试的ⅰ型鲤疱疹病毒、ⅱ型鲤疱疹病毒、ⅲ型鲤疱疹病毒和草鱼出血病毒核酸样品中，未检测到超过判读阈值的荧光信号，有利于降低近缘病原核酸引起的非特异性检测信号。

32、3.本发明的非对称rpa扩增、荧光探针杂交和emc均可在39 ℃条件下进行，不需要传统pcr的反复升温和降温过程，可采用恒温荧光检测装置完成反应和结果判读，有利于简化检测设备和操作过程。

33、4.本发明采用核酸粗提缓冲液处理离体鱼组织、全血或养殖水体沉淀样品，经裂解和离心后即可取上清液用于后续扩增，能够减少硅胶柱或磁珠纯化等操作步骤。在本发明实施例的检测条件下，质粒标准品的最低检出水平为100拷贝/反应，有利于离体样品中低含量cahv目标核酸的检测。

34、5.本发明的非对称rpa扩增、探针杂交和emc可在同一反应管内分步完成，无需将扩增产物转移至其他反应容器，能够减少扩增产物转移操作及由此产生的污染风险。样品粗提、扩增、酶切和荧光判读的总时间可控制在60 min以内，适用于cahv核酸的快速检测。