乳酸片球菌NM-12及其在发酵黄芪制备环黄芪醇中的应用

本发明属于微生物、发酵以及天然产物生物转化，具体涉及乳酸片球菌nm-12及其在发酵黄芪制备环黄芪醇中的应用。

背景技术：

1、黄芪为传统大宗药材，其皂苷类成分具有抗炎、免疫调节、心血管保护等多种药理活性。黄芪皂苷类成分均以环黄芪醇（cycloastragenol, cag）为共同苷元，根据糖链上糖基种类、数量及乙酰基取代情况的不同，可分为多种单体皂苷。环黄芪醇是迄今唯一能够激活端粒酶的天然化合物，具有抗衰老、增强免疫力、保护心血管等多种药理活性。黄芪皂苷类成分需经生物转化逐步脱去糖基，方可生成易吸收入血的环黄芪醇。然而，环黄芪醇在天然黄芪原料中含量极低，通常低于检测限，难以通过直接提取获得富含环黄芪醇的黄芪产品。因此，如何提升黄芪原料本身的环黄芪醇含量，而非依赖于昂贵的纯品制备，已成为黄芪深加工产业的核心技术瓶颈。

2、微生物发酵转化法因条件温和、特异性强而受到广泛关注，被认为是最有前景的提升黄芪原料活性成分含量的技术途径。黄芪原料中的皂苷类化合物主要包括乙酰化皂苷（黄芪皂苷ⅰ、ⅱ，异黄芪皂苷ⅰ、ⅱ）和非乙酰化皂苷（以黄芪甲苷为代表），两者的化学关系为：乙酰化皂苷=黄芪甲苷+木糖基上的乙酰基。黄芪甲苷虽是药典规定的质控指标，但其在黄芪原料中含量并非最高；黄芪皂苷ⅰ、ⅱ等乙酰化皂苷的含量往往更高。然而，乙酰化皂苷糖链上的乙酰基使其转化为环黄芪醇需要先去乙酰化、再脱糖基化的两级反应。目前研究主要集中于筛选可将黄芪甲苷直接脱糖基化的菌株或酶系，但这类菌株无法利用黄芪原料中含量更丰富的乙酰化皂苷前体，严重制约了发酵黄芪产品的品质升级。

3、人源肠道菌群虽可将多种黄芪皂苷转化为环黄芪醇，但来组成不稳定，难以食品化应用；九州虫草等真菌发酵后环黄芪醇含量反而下降，表明并非所有微生物均能有效提升黄芪原料中环黄芪醇的含量。现有乳酸片球菌发酵黄芪的报道则仅关注多糖提升，未涉及对乙酰化黄芪皂苷的定向去乙酰化-脱糖基化级联转化，也未从“提升黄芪原料本身环黄芪醇含量”的角度进行系统研究。

4、因此，筛选一株能安全、高效地发酵黄芪原料，通过一步发酵将乙酰化皂苷经去乙酰化和脱糖基化两级反应转化为环黄芪醇，从而直接获得高环黄芪醇含量发酵产品的食品级乳酸菌，并阐明其转化机制、建立简便工艺，对黄芪深加工产业的品质升级和功能性食品原料开发具有重要价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了乳酸片球菌nm-12及其在发酵黄芪制备环黄芪醇中的应用；本发明从内蒙古黄芪原料表面筛选分离了一株乳酸片球菌nm-12，所述乳酸片球菌nm-12保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：68607；所述乳酸片球菌nm-12能够制备微生物菌剂，所述乳酸片球菌nm-12及其微生物菌剂能够以乙酰化黄芪皂苷为底物发酵，将黄芪原料中的乙酰化黄芪皂苷转化为环黄芪醇，转化效率显著优于同种的其他菌株，具有很好的工业化应用前景。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：

3、本发明首先提供了一种乳酸片球菌nm-12，所述乳酸片球菌nm-12保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：68607，保藏日期为 2026年7月13日。

4、优选地，所述乳酸片球菌nm-12的16s rrna基因序列如seq id no: 1所示。

5、本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含所述乳酸片球菌nm-12。

6、本发明还提供了所述乳酸片球菌nm-12、或所述微生物菌剂在发酵黄芪生产环黄芪醇、或含有环黄芪醇的产品中的应用。

7、优选地，所述应用包括：发酵黄芪中的乙酰化黄芪皂苷和/或非乙酰化黄芪皂苷。

8、优选地，所述乙酰化黄芪皂苷包括黄芪皂苷ⅰ、异黄芪皂苷ⅰ或异黄芪皂苷ⅱ中的一种或多种。

9、本发明还提供了一种生产环黄芪醇的方法，所述方法基于所述乳酸片球菌nm-12、或所述微生物菌剂发酵底物实现；

10、所述底物包括黄芪、乙酰化黄芪皂苷、非乙酰化黄芪皂苷、含有乙酰化黄芪皂苷或非乙酰化黄芪皂苷的产品中的一种或多种。

11、优选地，所述方法包括：

12、将乳酸片球菌nm-12活化得到种子液，离心收集菌体，重悬得到乳酸片球菌nm-12的菌悬液；

13、将菌悬液与底物混合后发酵，得到含有环黄芪醇的发酵产物。

14、优选地，所述种子液的od值为0.8-1.0；

15、所述菌悬液与黄芪质量比为1:1；

16、所述菌悬液的od值为0.5-0.6。

17、优选地，所述黄芪经干燥、粉碎、灭菌处理，呈粉末状。

18、优选地，所述发酵的条件为：37℃下发酵24h。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、（1）本发明筛选得到了一株乳酸片球菌nm-12，该菌株分离自内蒙古黄芪原料表面，属于食品加工用菌种，安全可靠。经溶血性、生物膜形成、抗生素敏感性及全基因组安全性分析，确认该菌株符合食品加工用菌种的安全要求，可直接用于食品加工。

21、（2）本发明首次发现并证明了乳酸片球菌nm-12能够以黄芪皂苷ⅰ、异黄芪皂苷ⅰ和异黄芪皂苷ⅱ为底物，将其高效转化为环黄芪醇。底物特异性对比实验表明，在以乙酰化黄芪皂苷为底物时，nm-12的环黄芪醇生成量达4.18~5.33 mg/l，而同源分离的其他乳酸片球菌菌株（nm-1、nm-3、nm-5、nm-6）仅能检测到微量环黄芪醇（0.24~0.55 mg/l），同源分离的罗伊氏粘液乳杆菌（nm-10、nm-11）及实验室保藏菌株（atcc 8042、m1-1）则完全无法转化乙酰化皂苷。以固阳黄芪原料直接发酵时，nm-12的环黄芪醇产量（737.4 μg/g）分别为同源乳酸片球菌分离株（186.8~220.8 μg/g）的3.3~3.9倍、罗伊氏粘液乳杆菌分离株的7.3~8.1倍、乳酸片球菌标准株atcc 8042的7.7倍及银杏白果分离株m1-1的7.6倍。

22、本发明通过实验验证了乳酸片球菌nm-12具有其他乳酸片球菌不具有的乙酰化皂苷的高效转化能力，可将乳酸片球菌nm-12用于发酵黄芪原料并将黄芪原料中的乙酰化黄芪皂苷转化为环黄芪醇，从而直接获得富含环黄芪醇的黄芪发酵产品，具有很好的实用性。

23、（3）本发明首次通过全基因组测序和rt-qpcr技术，阐明了nm-12的转化机制：该菌株通过乙酰酯酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的协同表达，以多种皂苷为底物转化生成环黄芪醇。其中，当以黄芪皂苷ⅰ、异黄芪皂苷ⅰ、异黄芪皂苷ⅱ等乙酰化皂苷为底物时，需先由乙酰酯酶脱去乙酰基，再由β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶脱去糖基，最终生成环黄芪醇。

24、（4）本发明采用半固态发酵方式，操作简单、设备要求低、易于放大生产。相比未发酵时环黄芪醇含量为检测限以下，采用乳酸片球菌nm-12在最佳条件下（发酵温度35℃、发酵时间24h、料液比1:1）进行发酵得到的环黄芪醇含量提升至737.4 μg/g，发酵产物可直接作为富含环黄芪醇的功能性食品原料，无需复杂的提取分离步骤，具有很好的工业化应用前景。