一种检测补体依赖性细胞毒性的试剂盒、方法及应用

本发明涉及生物医药，具体来说，涉及一种检测补体依赖性细胞毒性的试剂盒、方法及应用。

背景技术：

1、视神经脊髓炎谱系疾病（nmosd）是一种高度致残，甚至危及生命的神经系统自身免疫性疾病。其核心病理机制主要涉及抗水通道蛋白4免疫球蛋白g（aqp4-igg）与星形胶质细胞表面的aqp4结合，随后通过经典途径激活补体，产生补体依赖性细胞毒性（cdc），最终导致视神经和脊髓受损。

2、目前，尽管aqp4-igg具有高度的诊断特异性，临床和实验室常规使用的基于细胞的检测法（cba）存在显著缺陷：cba仅能检测aqp4-igg与抗原的结合能力，无法区分致病性结合与非致病性结合。由于aqp4-igg阳性血清的致病性更多依赖于fc介导的效应功能效率，而非抗体滴度的绝对值，导致单纯的抗体滴度难以准确反映真实的疾病严重程度，两者之间的相关性欠佳。现有部分研究采用基于活细胞的检测法，通过向nmosd患者的热失活血清中加入外源性（人或兔）补体来评估细胞毒性。然而，此类方法忽略了人体内源性补体系统（如补体基因多态性）的个体变异，无法体现患者体内真实的免疫级联反应效率。现有的cba检测aqp4-igg的方法及添加外源性补体的细胞毒性检测法，均不足以准确监测和反映患者体内真实的总体血清细胞毒性。

3、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、本申请的技术任务是针对以上不足，提供一种检测补体依赖性细胞毒性的试剂盒、方法及应用，本申请通过表达aqp4与zsgreen的hek293t细胞作为靶细胞，结合7-aad死活细胞染色和流式细胞术，实现了对血清cdc活性的高通量、客观、定量检测。

2、为实现上述目的，本申请提供如下技术方案：

3、根据本申请的一个方面，提供了一种检测补体依赖性细胞毒性的方法，用于非诊断目的检测aqp4-igg阳性血清补体依赖性细胞毒性，包括：

4、s100、将人全长aqp4-m23 cdna克隆至fv115慢病毒载体的多克隆位点中，以构建aqp4-m23表达质粒；使用lipofectamine 3000试剂将aqp4-m23表达质粒瞬时转染至hek293t细胞中；转染6–24小时后，更换为含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的dmem完全培养基，继续培养24小时，获得瞬时表达aqp4且非融合独立表达zsgreen荧光蛋白的hek293t细胞，记为hek293t-aqp4细胞；

5、s200、将hek293t-aqp4细胞以每孔50,000个的密度接种于96孔板中，再培养18-24小时至细胞汇合；用pbs洗涤后，将细胞在室温下分别与各组样本孵育30分钟；使用accutase细胞消化液轻轻消化贴壁的hek293t-aqp4细胞，并用pbs 洗涤两次；向细胞悬液中加入5 μl 7-氨基放线菌素d进行染色，于室温下避光孵育10分钟；

6、其中，所述各组样本包括aqp4-igg阳性血清、阴性对照样本和阳性对照样本，其中，阴性对照样本为健康人血清，阳性对照样本为使用0.1% triton x-100处理后的hek293t-aqp4细胞；

7、s300、采用流式细胞仪检测存活靶细胞的百分比；采用以下公式计算细胞毒性指数值：

8、，

9、其中，

10、nsample：代表aqp4-igg阳性血清组存活靶细胞的百分比；

11、nneg：代表健康人血清组存活靶细胞的百分比；

12、npos：代表0.1% triton x-100处理后的hek293t-aqp4细胞组存活靶细胞的百分比；

13、所述采用流式细胞仪检测存活靶细胞的百分比，包括：

14、利用异硫氰酸荧光素通道检测内源性zsgreen信号；使用bd facsaria ii流式细胞仪进行数据采集，确保每个样本至少收集30,000个事件；使用flowjo软件进行数据分析；设门策略首先根据前向散射和侧向散射参数排除细胞碎片和粘连细胞；随后，将7-aad阴性且fitc阳性的细胞群鉴定为存活的靶细胞。

15、在一些实施例中，所述各组样本还包括：热灭活后的aqp4-igg 阳性血清样本和热灭活后的aqp4-igg 阳性血清且补充2.5%的混合正常人补体样本；所述热灭活是将血清放入56℃水浴锅中30min，以灭活补体。

16、在一些实施例中，步骤s200前还包括采用免疫荧光法评估aqp4-igg的结合情况。

17、在一些实施例中，所述采用免疫荧光法评估aqp4-igg的结合情况，包括：将hek293t-aqp4细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，然后用5%牛血清白蛋白封闭30分钟；随后，与待测血清孵育1小时；经pbs洗涤后，细胞与alexa fluor 555标记的抗人igg抗体孵育45分钟；再次以pbs洗涤后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核复染，封片后置于荧光显微镜下观察分析。

18、根据本申请的另一个方面，提供了一种检测补体依赖性细胞毒性的试剂盒，所述试剂盒包括瞬时表达aqp4且非融合独立表达zsgreen荧光蛋白的hek293t细胞、健康人血清、0.1% triton x-100溶液、accutase细胞消化液和7-氨基放线菌素d。

19、根据本申请的另一个方面，提供了所述的方法或者所述的试剂盒在药物筛选中的应用。

20、在一些实施例中，所述药物筛选是对急性期nmosd患者进行激素冲击治疗后，筛选能够挽救无应答患者的药物的过程。

21、与现有技术相比，本申请的优点和积极效果在于：本申请通过表达aqp4与zsgreen的hek293t细胞作为靶细胞，结合7-aad死活细胞染色和流式细胞术，实现了对血清cdc活性的高通量、客观、定量检测。

22、进一步地，本申请利用独立的泛素启动子驱动zsgreen表达，使报告基因与aqp4以非融合形式独立表达，完全避免了融合标签对aqp4蛋白结构完整性及生物学功能的影响，确保了检测结果能真实反映生理状态下aqp4-igg介导的补体依赖性细胞毒性。

23、进一步地，本申请通过设立健康人血清阴性对照和0.1% triton x-100阳性对照，采用归一化公式计算细胞毒性指数（ci），能够消除实验批次间差异，实现不同时间、不同实验室间cdc活性的可量化比较。

24、进一步地，本申请在检测体系中包含热灭活血清组及外源补体补充组，能够明确区分cdc是否由补体介导，并可独立评估内源性补体与外源性补体的贡献，为实验体系的质控和机制验证提供了可靠参照。

25、进一步地，本申请所提供的试剂盒中包含冻存或即用型的靶细胞、死活染料及对照品，操作流程标准化，可在临床实验室或科研机构中简便、快速地开展，适用于药物筛选、补体活性评估等多种非诊断目的。

1.一种检测补体依赖性细胞毒性的方法，其特征在于，用于非诊断目的检测aqp4-igg阳性血清补体依赖性细胞毒性，包括：

2.根据权利要求1所述的一种检测补体依赖性细胞毒性的方法，其特征在于，所述各组样本还包括：热灭活后的aqp4-igg 阳性血清样本和热灭活后的aqp4-igg 阳性血清且补充2.5%的混合正常人补体样本；所述热灭活是将血清放入56℃水浴锅中30min，以灭活补体。

3.根据权利要求1所述的一种检测补体依赖性细胞毒性的方法，其特征在于，步骤s200前还包括采用免疫荧光法评估aqp4-igg的结合情况。

4.根据权利要求3所述的一种检测补体依赖性细胞毒性的方法，其特征在于，所述采用免疫荧光法评估aqp4-igg的结合情况，包括：

5.一种检测补体依赖性细胞毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括瞬时表达aqp4且非融合独立表达zsgreen荧光蛋白的hek293t细胞、健康人血清、0.1% triton x-100溶液、accutase细胞消化液和7-氨基放线菌素d。

6.权利要求1-4任一项所述的方法或权利要求5所述的试剂盒在药物筛选中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物筛选是对急性期nmosd患者进行激素冲击治疗后，筛选能够挽救无应答患者的药物的过程。