一种微生物快速检测方法

本发明涉及微生物检测，特别涉及一种微生物快速检测方法。

背景技术：

1、血流感染（bloodstream infection，bsi）是由细菌、真菌等病原微生物侵入血液循环系统并大量繁殖所引发的急性感染性疾病，是临床脓毒症的主要致病原因。bsi起病急骤、进展迅速，短时间内即可引发感染性休克等严重并发症，早期准确鉴定病原菌种类并及时开展抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility testing，ast），对于实施针对性抗菌治疗、降低患者死亡率及改善预后至关重要。然而，bsi早期病原体负荷极低，最低可达1 cfu/ml，远低于常规检测方法的检出限；同时血液基质成分复杂，血红蛋白、免疫球蛋白等干扰物质显著增加了检测难度与假阴性风险。

2、在医药生产与质量控制领域，药品无菌检查是保障用药安全的重要法定项目。依据各国药典标准，现行药品无菌检测主要采用薄膜过滤法与直接接种法，依靠微生物培养进行判定，检测周期长达14天。由于检测结果出具时间过长，企业无法在生产放行前及时发现污染批次，通常只能先行放行并进入仓储、流通乃至临床使用环节，一旦后续检出阳性，将面临大规模召回、停产、销毁及巨额赔偿，经济损失与安全风险均极为严重。

3、因此，无论是面向临床bsi快速诊断，还是面向药品无菌快速筛查，均迫切需要一种兼具快速性、高灵敏度、抗干扰能力及自动化程度的检测技术。

4、然而，目前临床与医药行业中现有的检测手段均存在显著局限。具体而言，现有技术主要存在以下不足：

5、（1）传统检测方法的耗时过长。临床通用的血培养法完成致病菌生长判定需24-48小时，后续菌种鉴定与ast仍需额外24-72小时，全套流程完成往往需要数日；药品无菌检测依据药典标准长达14天，完全无法满足重症患者急诊救治的时效要求与药企快速质控的生产需求。

6、（2）低丰度致病菌的检出能力不足。无论是早期感染患者血液样本中的微量病原体，还是无菌药品抽检样本中可能残留的污染菌，其中致病菌含量均极低，而现有常规检测手段灵敏度不足，极易导致漏检，无法实现微量致病菌的稳定、精准检出。

7、（3）样本基质干扰严重影响检测精度。人体全血样本中含有血红蛋白、免疫球蛋白、脂质及各类蛋白质等内源性杂质，药品检测样本中也存在多种制剂辅料及基质成分，上述物质均会干扰核酸反应体系正常运行与荧光信号的有效采集，导致检测背景偏高，显著降低检测的准确性与稳定性。

8、（4）现有检测模式功能较为单一。多数快速检测手段仅能实现致病菌的初步筛查，无法同步开展表型ast，无法出具临床可直接参考的药敏结果，难以有效指导临床合理选用抗菌药物，亦无法形成集筛查、鉴定、药敏于一体的完整检测体系。

9、（5）检测操作流程复杂、自动化程度低。现有检测方法大多属于劳动密集型操作，对操作人员的专业技能要求较高，不仅不利于基层医疗机构的普及使用，也难以适应药企大批量、自动化无菌检测作业的需求。

10、综上所述，现有技术无法同时满足快速、高灵敏、抗干扰、简便以及兼容临床致病菌检测与药品无菌检测的多维度需求。因此，开发一种能够一体化实现上述功能的新方法，已成为本领域亟待解决的关键技术问题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种微生物快速检测方法。本发明中的方法基于自研专用裂解液能够实现对于各类微生物菌株的快速检测，且能够适用于多种样本体系，包括临床血液样本、药品样本等，能够用于开展感染诊断和ast，同时可以拓展适用于尿液、医疗器械等其他样本的无菌检验场景，具有极好的通用性。

2、本发明的第一个方面，提供了一种病原微生物的检测方法，包括如下步骤：

3、s1，对待测样本进行裂解，释放病原菌靶标核酸；

4、s2，将所述靶标核酸与dnazyme识别体系接触，使所述dnazyme响应病原菌靶标核酸发生切割反应，并释放铜基信号载体；

5、s3，将所述铜基信号载体酸化还原生成催化活性铜离子，催化铜催化点击反应形成信号转换产物；

6、s4，对所述信号转换产物进行检测，并根据检测信号确定待测样本中病原菌的存在和/或含量。

7、在本发明的一些实施方式中，所述检测方法还包括：在s3之后进一步进行核酸信号放大后再进行检测。

8、在本发明的一些实施方式中，所述核酸信号放大包括：使用杂交链式反应(hcr)进行核酸信号放大。

9、在本发明的一些实施方式中，所述dnazyme识别体系能够识别细菌16s rrna和/或真菌18s rrna保守序列。

10、在本发明的一些实施方式中，所述dnazyme识别体系包括：探针序列或者与其具有相同病原菌靶标识别及切割功能的核酸序列、底物链（sub）、氧化铜串联连接链c1和c2、点击反应复合链和杂交链式反应复合链。

11、在本发明的一些实施方式中，所述探针序列包括seq id no：1-20中的至少一种。

12、在本发明的一些实施方式中，所述探针序列可以基于目标检测物进行合理调整设计，包括但不应当限制于seq id no：1-20中的至少一种。

13、在本发明的一些实施方式中，所述底物链如seq id no：18所示。

14、在本发明的一些实施方式中，所述底物链可以基于具体使用场景和使用需求进行合理调整，包括但不限于使用seq id no：18所示的底物链。

15、在本发明的一些实施方式中，所述氧化铜串联连接链c1和c2如seq id no：19-20所示。

16、在本发明的一些实施方式中，所述点击反应复合链包括或由：seq id no：21和22组成。

17、在本发明的一些实施方式中，所述级联反应试剂中包括若干对所述杂交链式反应复合链。

18、在本发明的一些实施方式中，所述级联反应试剂中包括2对杂交链式反应复合链。

19、在本发明的一些实施方式中，所述杂交链式反应复合链包括：seq id no：23-24和25-26。

20、在本发明的一些实施方式中，seq id no：23-24配合使用（形成复合物），seq idno：25-26配合使用（形成复合物）。

21、在本发明的一些实施方式中，所述铜基信号载体包括：氧化铜磁珠、氧化铜纳米颗粒、氧化亚铜纳米颗粒或其他能够参与点击反应的铜基材料。

22、在本发明的一些实施方式中，所述裂解包括：采用温和型裂解液或快速型裂解液进行裂解。

23、在本发明的一些实施方式中，所述温和型裂解液用于裂解血液样本中的微生物。

24、在本发明的一些实施方式中，所述血液样本包括：全血样本、血清样本或血浆样本。

25、在本发明的一些实施方式中，所述快速型裂解液用于裂解非全血样本中的微生物。

26、在本发明的一些实施方式中，所述温和型裂解液中包括：edta、溶菌酶、rnase抑制剂及蔗糖。

27、在本发明的一些实施方式中，所述温和型裂解液中还包括：溶剂。

28、在本发明的一些实施方式中，所述溶剂包括：缓冲液或水。

29、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液包括：tris-hcl缓冲液。

30、在本发明的一些实施方式中，所述温和型裂解液由edta、溶菌酶、rnase抑制剂、蔗糖和tris-hcl缓冲液组成。

31、在本发明的一些实施方式中，按终浓度计，所述温和型裂解液中包括：edta：5-40mm；溶菌酶：0.2-2 mg/ml；rnase抑制剂：0.2-2 u/μl；蔗糖：0.5%-4%。

32、在本发明的一些实施方式中，按终浓度计，所述温和型裂解液中包括：10 mmedta、1 mg/ml 溶菌酶；1 u/μl rnase抑制剂、3% 蔗糖；50 mm 缓冲液。

33、在本发明的一些实施方式中，所述快速型裂解液中包括：edta、氢氧化钠和tritonx-100。

34、在本发明的一些实施方式中，按终浓度计，所述快速型裂解液中包括：edta：5-40mm；氢氧化钠：0.05-1 m；triton x-100：0.1-1%。

35、在本发明的一些实施方式中，按终浓度计，所述快速型裂解液中包括：10 mmedta、0.1 m氢氧化钠、0.5%triton x-100。

36、所述待测样本包括全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、腹水、胸腹腔积液、生物制品、药品、医疗器械洗脱液中的一种或多种。

37、在本发明的一些实施方式中，所述微生物包括：细菌和真菌。

38、在本发明的一些实施方式中，所述细菌包括：革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

39、在本发明的一些实施方式中，所述微生物包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、白色念珠菌。

40、本发明的第二个方面，提供了上述方面检测方法在病原菌检测、抗菌药物敏感性分析和药品无菌检测中的应用。

41、在本发明的一些实施方式中，所述应用均不涉及疾病的诊断。

42、本发明的第三个方面，提供了一种微生物检测产品，所述微生物检测产品中包括：上述方面所述的裂解液和dnazyme识别体系。

43、在本发明的一些实施方式中，所述微生物检测产品中还包括：溶剂。

44、在本发明的一些实施方式中，所述微生物检测产品的形式包括检测试剂、检测试剂盒或套装。

45、本发明的第四个方面，提供了上述方面所述的微生物检测产品在微生物检测中的应用。

46、本发明的第五个方面，提供了上述方面所述微生物检测产品在构建抗菌药物筛选平台中的应用。

47、本发明的第六个方面，提供了上述方面所述微生物检测产品在菌株筛选中的应用。

48、在本发明的一些实施方式中，所述菌株包括敏感菌株和抗性菌株。

49、本发明的有益效果是：

50、1. 本发明首创全新的检测方式，并有效提高了检测灵敏度与时效性。本发明中的方法突破了传统单一信号放大策略的局限，创新性地构建了“靶标识别–dnazyme切割–点击化学偶联–杂交链式反应”的多级级联信号放大体系。该体系中，各级反应按预设顺序紧密偶联、逐级驱动，实现了信号转导、化学连接与核酸放大的深度融合与协同增效。基于该级联逻辑，本发明能够将微弱的靶标识别事件转化为显著且可精准定量的荧光信号，从而实现对低至1 cfu/ml级别致病菌的稳定检出。同时，得益于高效的样本前处理与级联放大反应的高效协同，bsi及药品无菌检测整体耗时缩短至2小时内，药敏检测时间缩短至5小时内，从根本上解决了临床急救时效性与药企无菌质控周期过长的难题。

51、2. 本发明中的方法能够实现病原鉴定、表型药敏与无菌检测的三位一体功能集成。本发明中的方法不仅提供高灵敏度的病原菌定性/定量检测。这一设计使同一平台同步完成致病菌表型ast检测成为可能，形成了从筛查、鉴定、药敏到无菌检测的一体化技术方案。相比仅提供核酸检测结果的分子生物学方法，本发明中的方法更符合临床用药决策的实际需求，同时一套系统可同时满足临床诊断与医药、器械质控等多场景应用。

52、5. 本发明针对不同应用场景提供两种专用裂解体系：温和型裂解液具备低溶血、低背景特性，可在全血样本中直接实现病原菌的完全裂解，省去复杂前处理步骤；而快速型裂解液可在2分钟内完成非全血样本（如药品无菌检测样本）中细菌的高效裂解，且无需加热，操作简单、通用性强。两种方案协同作用，确保了本发明中的方法对复杂样本的高效处理能力和优异抗干扰能力，进一步提高检测结果的准确性与可靠性。

53、6. 本发明中核心级联逻辑具有较好的可替换性与拓展性。本发明中的多级级联放大逻辑并非依赖于单一特定酶或反应，可以基于目标物对其前级切割识别体系（如dnazyme、铜基纳米材料）及后级核酸放大体系（如杂交链式反应）进行适应性调整，在确保“靶标识别→切割触发→点击偶联→链式放大”核心逻辑不变的前提下，各功能模块具备丰富的可替换性，显著提升了本发明中的方法的可应用场景。