新型生物制品生产系统

本申请涉及用于表达目的基因的表达系统。

背景技术：

1、大多数生物制药是在高等真核(通常是哺乳动物)细胞系中生产的，因为这提供了功能所需的“类人”翻译后修饰[1]。细胞工厂是基因修饰的细胞，针对生物制药的工业生产进行了优化。历史上，若干种人和鼠细胞系已被用作生产生物制药的细胞工厂。用于制造治疗性蛋白质的行业标准细胞工厂平台现在使用适应工业生物加工方法的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的变体[2]。商业cho细胞变体是针对细胞生长所必需的关键营养素(诸如氨基酸或核苷)的天然或工程化营养缺陷型[3]。这可以被利用来提供选择系统。有两个关键的商业选择系统，其依赖于酶谷氨酰胺合酶(gs)和二氢叶酸还原酶(dhfr)。两个系统都通过酶的小分子量抑制剂增强：用于gs的甲硫氨酸亚砜亚胺(msx)和用于dhfr的甲氨蝶呤(mtx)，这使得能够分离或扩增表达目的基因的细胞，该目的基因与共表达的重组goi基因地连接，导致更高的蛋白质表达，使得这些细胞适合商业用途。

2、nad+、nadh、nadp+和nadph对于细胞功能和细胞生长至关重要，通过偶联的脱氢酶反应支持分解代谢和生物合成反应。这些反应生成支持细胞分裂和相关代谢相互转化所需的辅因子。nad+生物合成对于其他三种烟酰胺腺嘌呤辅酶的生物合成至关重要。在哺乳动物细胞中，nad+合成经由三条路径之一发生：普莱斯 - 汉德勒(preiss-handler)；从头和补救途径(其示于图1中)。补救途径对于维持细胞nad+池至关重要[4]。

3、nad+和相关辅酶的生物合成通过来自色氨酸的从头途径或者通过利用烟酰胺作为合成前体的合成途径来完成。从头途径酶在哺乳动物中主要定位于肝细胞中[4]。经由合成途径的烟酰胺磷酸核糖基化代表了中国仓鼠卵巢(cho)细胞中nad+合成的主要路径。烟酸的磷酸核糖基化作为次要替代前体，用于使用特定的磷酸核糖基转移酶进行合成，这些特定的磷酸核糖基酶共用从头合成途径中的最终相互转化[5、6、7]。

4、在过去的5-10年中，nampt在肿瘤细胞发展中的重要性日益受到关注，其中nampt的高表达已与恶性表型相关联[8]。

5、已经开发了若干种nampt抑制剂(例如gmx1778和fk866)[9]，其在若干种肿瘤细胞疗法中显示出临床前景[10、11]。nampt在细胞nad+合成中的重要性已通过鉴定出在培养的人肺细胞中选择性激活nampt的化合物得到佐证，导致细胞nad+浓度增加[12]。这些研究证明了nad+生物合成的合成途径对于细胞生长和健康的至关重要性，其用特异性的强效nampt抑制剂，确立了高度易处理的系统以增强细胞代谢和生物合成。

技术实现思路

1、在本发明的第一方面，提供了一种用于选择目的基因存在的表达系统，所述表达系统包括：

2、(i) 细胞系，其中，nad+合成途径中的至少一种酶的活性被至少部分地抑制，

3、所述细胞系任选地进一步包括所述目的基因，并且所述细胞系任选地缺少编码所述nad+合成途径中的所述至少一种酶的内源性核苷酸序列；

4、(ii) 表达载体，所述表达载体包括编码所述nad+合成途径中的所述至少一种酶的外源性核苷酸序列；以及

5、(iii) 培养基制剂，所述培养基制剂不包括烟酰胺(nam)和/或烟酸。

6、在本发明的另一方面，提供了一种细胞系，其中，nad+合成途径中的至少一种酶的活性被至少部分地抑制，任选地进一步包括目的基因，并且任选地缺少编码所述nad+合成途径中的至少一种酶的内源性核苷酸序列。

7、在本发明的另一方面，提供了一种表达载体，其包括编码nad+合成途径中的至少一种酶的外源性核苷酸序列，并任选地包括目的基因。

8、在本发明的另一方面，提供了一种培养基制剂，所述培养基制剂不包括烟酰胺(nam)和/或烟酸。

9、在一些实施方式中，目的基因由表达载体和/或由第二载体编码。

10、在一些实施方式中，所述细胞系包括所述表达载体。

11、在一些实施方式中，nad+合成途径中的所述至少一种酶选自烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)、烟酸磷酸核糖基转移酶(nprt)和/或喹啉酸磷酰基转移酶(qprt)。

12、在一些实施方式中，所述nad+合成途径中的所述至少一种酶是异源哺乳动物nampt。

13、在一些实施方式中，所述nad+合成途径中的所述至少一种酶与seq id 1至8具有至少70%的序列同一性。

14、在一些实施方式中，所述目的基因编码重组蛋白、病毒载体、病毒载体的组分、病毒疫苗、细胞内蛋白和/或受体。

15、在一些实施方式中，编码所述nad+合成途径中的所述至少一种酶的外源性核苷酸序列处于启动子的控制下，任选地其中，所述启动子是cmv、sv40和/或mpgk。

16、在一些实施方式中，所述目的基因处于启动子的控制下，任选地其中，所述启动子是cmv、sv40和/或mpgk。

17、在一些实施方式中，所述细胞系是真核细胞系，任选地选自：中国仓鼠卵巢ki细胞；hek细胞；和/或vero细胞。

18、在一些实施方式中，所述细胞系被基因工程改造以缺少编码所述nad+合成途径中的所述至少一种酶的内源性核苷酸序列。

19、在一些实施方式中，所述培养基制剂进一步包括抑制剂，任选地其中，所述抑制剂是转移酶抑制剂。

20、在一些实施方式中，所述转移酶抑制剂是烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)抑制剂。

21、在一些实施方式中，所述培养基制剂是基本上无血清和/或无蛋白质的培养基。

22、在本发明的另一方面，提供了一种使用所述表达系统、细胞系、表达载体或培养基制剂来选择包括目的基因的细胞的方法。

23、在本发明的另一方面，提供了一种使用所述培养基制剂来培养和/或扩增所述细胞系的方法。

24、在本发明的另一方面，提供了所述表达系统的用途，其中，不包括所述nad+合成途径中的所述至少一种酶的细胞不存活。

1.一种用于选择目的基因存在的表达系统，所述表达系统包括：

2.一种细胞系，其中，nad+合成途径中的至少一种酶的活性被至少部分地抑制，任选地进一步包括目的基因，并且任选地缺少编码所述nad+合成途径中至少一种酶的内源性核苷酸序列。

3.一种表达载体，其包括编码nad+合成途径中的至少一种酶的外源性核苷酸序列，并任选地包括目的基因。

4.一种培养基制剂，其不包括烟酰胺(nam)和/或烟酸。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的表达系统或细胞系或表达载体，其中，所述目的基因由所述表达载体和/或由第二载体编码。

6.根据权利要求1至3或5中任一项所述的表达系统或细胞系，其中，所述细胞系包括所述表达载体。

7.根据权利要求1至3或5至6中任一项所述的表达系统、细胞系或表达载体，其中，所述nad+合成途径中的所述至少一种酶选自烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)、烟酸磷酸核糖基转移酶(nprt)和/或喹啉酸磷酰基转移酶(qprt)。

8.根据权利要求7所述的表达系统、细胞系或表达载体，其中，所述nad+合成途径中的所述至少一种酶是异源哺乳动物nampt。

9.根据权利要求8所述的表达系统、细胞系或表达载体，其中，所述nad+合成途径中的所述至少一种酶与seq id 1至8具有至少70%的序列同一性。

10.根据权利要求1至3或5至9中任一项所述的表达系统、细胞系或表达载体，其中，所述目的基因编码重组蛋白、病毒载体、病毒载体的组分、病毒疫苗、细胞内蛋白和/或受体。

11.根据权利要求1至3或5至10中任一项所述的表达系统、细胞系或表达载体，其中，编码所述nad+合成途径中的所述至少一种酶的外源性核苷酸序列处于启动子的控制下，任选地其中，所述启动子是cmv、sv40和/或mpgk。

12.根据权利要求1至3或5至11中任一项所述的表达系统、细胞系或表达载体，其中，所述目的基因处于启动子的控制下，任选地其中，所述启动子是cmv、sv40和/或mpgk。

13.根据权利要求1至2或5至12中任一项所述的表达系统或细胞系，其中，所述细胞系是真核细胞系，任选地选自：中国仓鼠卵巢ki细胞；hek细胞；和/或vero细胞。

14.根据权利要求1至2或5至13中任一项所述的表达系统或细胞系，其中，所述细胞系被基因工程改造以缺少编码所述nad+合成途径中的至少一种酶的内源性核苷酸序列。

15.根据权利要求1或4至14中任一项所述的表达系统或培养基制剂，其中，所述培养基制剂进一步包括抑制剂，任选地其中，所述抑制剂是转移酶抑制剂。

16.根据权利要求15所述的表达系统或培养基制剂，其中，所述转移酶抑制剂是烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)抑制剂。

17.根据权利要求1或4至16中任一项所述的表达系统或培养基制剂，其中，所述培养基制剂是基本上无血清和/或无蛋白质的培养基。

18.一种使用根据权利要求1至17中任一项所述的表达系统、细胞系、表达载体或培养基制剂来选择包括目的基因的细胞的方法。

19.一种使用根据权利要求4和15至17中任一项所述的培养基制剂来培养和/或扩增根据权利要求1、2、5至14中任一项所述的细胞系的方法。

20.根据权利要求1至17中任一项所述的表达系统的用途，其中，不包括所述nad+合成途径中的至少一种酶的细胞不能存活。