鉴定水稻耐盐基因OsPi3/4k3突变体的KASP分子标记引物组及其应用的制作方法

本发明属于水稻分子生物技术与分子标记辅助育种，具体涉及鉴定水稻

ospi3/4k3基因突变体的kasp分子标记引物组及其应用。

背景技术：

1、水稻(

oryza sativa l .)是重要粮食作物，土壤盐渍化严重制约水稻生产，挖掘耐盐相关基因、开发功能分子标记，对耐盐水稻分子育种具有重要价值。

2、本课题组利用crispr/cas9获得水稻

ospi3/4k3基因5' utr区域缺失突变体

ospi3/4k3，该突变体的

ospi3/4k3基因表达显著下调，参与水稻盐胁迫应答，是水稻耐盐机理研究与耐盐育种重要遗传材料。

3、传统基因型鉴定手段主要采用pcr-电泳、测序，操作繁琐，通量低，难以满足育种群体大样本快速分型需求。kasp（竞争性等位基因特异性pcr）技术为高通量、低成本的snp/indel分型技术，可实现96 孔、384孔板高通量样本检测，结果准确，适合育种群体大规模基因型筛选。目前尚未有针对

ospi3/4k3的kasp功能分子标记被公开报道。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供鉴定水稻耐盐基因

ospi3/4k3突变体的kasp分子标记引物组及其应用。以实现高通量快速区分野生型纯合、突变纯合、杂合基因型，弥补传统检测手段通量低、操作繁琐的缺陷，用于突变体材料鉴定、耐盐水稻分子标记辅助育种。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种用于鉴定水稻耐盐基因

ospi3/4k3突变体的kasp分子标记引物组，所述引物组由序列如seq id no.4所示的野生型特异性正向引物、序列如seqid no.5所示的突变型特异性正向引物以及序列如seq id no.6所示的反向共用引物组成；

4、所述seq id no.4序列：gaaggtgaccaagttcatgctaggagaaaaaccaagcgaaccc；

5、所述seq id no.5序列：gaaggtcggagtcaacggattgaggagaaaaaccaagcgaacca；

6、所述seq id no.6序列：tactgctcccgcacccgctg。

7、进一步地，seq id no.4的5' 端携带fam荧光接头序列，seq id no.5的5' 端携带hex荧光接头序列。

8、本发明第二方面提供了一种用于鉴定水稻耐盐基因

ospi3/4k3突变体的检测试剂盒，包含所述的kasp分子标记引物组。

9、进一步地，还包括kasp pcr 反应mix、无菌水。

10、本发明第三方面提供了一种鉴定水稻耐盐基因

ospi3/4k3突变体或野生型的方法，使用所述引物组或者所述试剂盒，包括如下步骤：

11、（1）提取待测水稻样本基因组dna；

12、（2）以基因组dna为模板，采用所述引物组进行pcr扩增反应，获得pcr产物；

13、（3）对pcr产物采用荧光检测平台进行检测，读取扩增产物荧光信号，根据所得荧光信号判读基因型：

14、若仅检测到fam荧光信号，待测水稻样本为野生型，盐胁迫条件下表现盐敏感性状；

15、若仅检测到hex荧光信号，待测水稻样本为

ospi3/4k3基因纯合突变体，盐胁迫条件下表现耐盐性状；

16、若同时检测到fam与hex两种荧光信号，待测水稻样本为

ospi3/4k3基因杂合突变体，盐胁迫条件下表现盐敏感性状；

17、所述突变体的

ospi3/4k3基因gdna序列为seq id no.7，所述野生型的

ospi3/4k3基因gdna序列为seq id no.1。

18、进一步地，pcr反应程序为：94℃预变性15 min；94℃ 20 s，61-55℃梯度退火60s，10个循环，每个循环退火温度降低0.6℃；94℃ 20 s，55℃ 60 s，26-30 个循环。

19、本发明第四方面提供了所述kasp分子标记引物组或所述试剂盒或所述的鉴定方法在鉴定水稻耐盐基因

ospi3/4k3突变体或水稻耐盐基因

ospi3/4k3分子标记育种中的应用。

20、本发明有益效果：

21、1、本发明针对

ospi3/4k3基因5' utr缺失突变位点开发kasp共显性分子标记，可一次性区分野生型纯合

、突变纯合、杂合三种基因型，分型结果稳定可靠。

22、2、基于kasp高通量pcr平台，可实现96/384孔板大批量样本检测，无需琼脂糖凝胶电泳，大幅提升检测效率，降低人力成本，适合育种分离群体大规模基因型筛选。

23、3、标记为功能型分子标记，直接靶向突变位点，不会发生遗传重组交换造成标记与目标位点分离，鉴定准确度高，可用于苗期叶片取样早期鉴定，加速耐盐水稻育种进程。

1.一种用于鉴定水稻耐盐基因ospi3/4k3突变体的kasp分子标记引物组，其特征在于，所述引物组由序列如seq id no.4所示的野生型特异性正向引物、序列如seq id no.5所示的突变型特异性正向引物以及序列如seq id no.6所示的反向共用引物组成；

2.一种用于鉴定水稻耐盐基因ospi3/4k3突变体的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的kasp分子标记引物组。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括kasp pcr 反应mix、无菌水。

4.一种鉴定粳稻耐盐基因ospi3/4k3突变体或野生型的方法，其特征在于，使用权利要求1所述引物组或者权利要求2-3任一项所述试剂盒，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应的程序为：94℃预变性15min；94℃ 20 s，61-55℃梯度退火60 s，10个循环，每个循环退火温度降低0.6℃；94℃ 20s，55℃ 60 s，26-30 个循环。

6.权利要求1所述kasp分子标记引物组或权利要求2所述试剂盒或权利要求4-5任一项所述的方法在鉴定水稻耐盐基因ospi3/4k3突变体或水稻耐盐基因ospi3/4k3分子标记育种中的应用；