一种高效低成本的固相合成寡核苷酸的方法与流程

本发明涉及寡核苷酸合成，特别涉及固相合成寡核苷酸的方法。

背景技术：

1、目前随着核酸新药的兴起，寡核苷酸的需求也日益增加。尽管寡核苷酸的酶促合成法已经日趋完善，但固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸，仍然会在今后一段时间内继续作为寡核苷酸的主要合成方式。

2、目前，固相亚磷酰胺三酯法是通过固相载体与试剂反应，抽干/吹干，再与下一个试剂反应的模式合成，其合成单链寡核苷酸过程包括脱保护、活化、偶联、氧化和盖帽；并且以这5个化学反应为一个循环，中间某些过程需要加入乙腈清洗固相载体，保证上一步试剂被清洗干净，不影响下一步反应。每1次循环都能在固相载体上连接1个核苷酸单体，最终通过若干循环，将一个个核苷酸单体通过磷酸二酯键连接并固定在固相载体上。最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（cpg，controlled pore glass）。cpg通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合，cpg的羟基用二甲氧基三苯甲基（dmt）保护。

3、目前行业内针对固相合成寡核苷酸过程，一般选用专门的寡核苷酸合成仪制备获得寡核苷酸。常规的固相亚磷酰胺三酯法合成单链寡核苷酸的具体反应步骤如下。

4、（1）清洗（wash）：采用清洗试剂清洗固相载体。气流压力操作一般需要先小压和等待，再进行大压，该过程总共耗时5-10 s。

5、（2）脱帽（deblocking）：用脱帽剂去除cpg上羟基的保护基团dmt，以暴露5’羟基，供下一步偶联。脱帽过程一般设置若干次。

6、（3）脱帽过程对脱帽剂和固相载体进行气流压力操作。气流压力操作一般需要先小压和等待，重复几次，再进行大压。该过程总共耗时20-40 s。

7、（4）活化（activation）：在活化之前，单体与活化剂混合并进入合成柱。此时活化剂提供一个质子给3’磷酸上二异丙胺基的n原子，质子化的二异丙胺是一个游离基团，与活化剂形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。此步的活化剂过量，保证了单体活化充分。

8、偶联（coupling）：亚磷酰胺四唑与cpg上的5’羟基发生亲核反应，发生偶联并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。

9、活化偶联过程一般设置若干次。

10、（5）活化偶联过程对活化偶联剂和固相载体进行气流压力操作。气流压力操作一般需要先等待和小压，重复几次，再等待，最后进行大压。该过程总共耗时30-60 s。

11、（6）氧化（oxidation）：偶联反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与cpg上的寡核苷酸链相连。此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解。因此加入氧化剂将三价磷氧化成5价磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。氧化过程一般设置若干次。

12、（7）氧化过程对氧化剂与固相载体进行气流压力操作。气流压力操作一般需要先小压和等待，重复几次，最后进行大压。该过程总共耗时30-60 s。

13、（8）盖帽（capping）：为了防止未反应的5’羟基在随后的循环中继续参与反应（n-1缺失片段的主要产生原因），需要在最后加入盖帽剂使其封闭。常用乙酰化来封闭此羟基。盖帽过程一般设置若干次。

14、（9）盖帽过程对盖帽剂与固相载体进行气流压力操作。气流压力操作一般需要先等待和小压，重复几次，再等待，最后进行大压。该过程总共耗时20-40 s。

15、（10）循环：循环上述5步化学反应，寡核苷酸链延伸至所需长度时即可完成。

16、可见，采用上述固相亚磷酰胺三酯法合成单链寡核苷酸时，每个重要步骤结束后，为了使试剂和载体接触并充分反应，往往需要进行小压；为了把试剂完全排出载体，避免影响下一步反应，往往需要进行大压。目前常用的寡核苷酸合成仪一般选用抽吸或喷吹的方式完成上述处理。这些气流压力操作是保证合成质量的关键流程。

技术实现思路

1、本发明提供了一种高效低成本的固相合成寡核苷酸的方法，脱帽、活化偶联、氧化和盖帽都进行至少两次反应。更重要的是，本发明对脱帽、活化偶联、氧化和盖帽的气流压力操作方式进行优化，删除了部分大压操作，保留部分试剂在载体上继续反应；同时减少部分试剂用量，调整小压时间，保证最后一步小压后有少量试剂在固相载体表面，在机器运作中继续参与反应，然后直接喷打第二遍试剂反应。最终在保证反应成功率的同时，显著缩减了合成时间，减少了合成试剂量。具体通过以下技术实现。

2、本发明提供了一种高效低成本的固相合成寡核苷酸的方法，包括以下步骤：

3、对固相载体合成柱进行第一清洗；

4、对经过第一清洗的所述固相载体合成柱进行2次脱帽；第1次脱帽进行第一小压；第2次脱帽进行第二小压和1次第一大压；

5、对经过脱帽处理的所述固相载体合成柱进行第二清洗；

6、对经过第二清洗的所述固相载体合成柱进行若干次活化偶联；除最后1次活化偶联以外的其他每次活化偶联都进行第三小压；最后1次活化偶联进行第四小压和1次第二大压；

7、对经过活化偶联的所述固相载体合成柱进行两次氧化；第一次氧化进行第五小压；第二次氧化进行第六小压和1次第三大压；

8、对经过氧化的所述固相载体合成柱进行两次盖帽；第一次盖帽进行第七小压；第二次盖帽进行第八小压和1次第三大压；

9、根据寡核苷酸长度循环相应次数，循环结束后对所述固相载体合成柱进行氨解、干燥、洗脱，获得寡核苷酸。

10、进一步地，所述第一小压的方法为：小压0.3 s，等待10 s，小压0.3 s，等待10 s，小压0.3 s，等待4 s。

11、进一步地，所述第二小压的方法为：小压0.3 s，等待10 s，小压0.3 s，等待10 s，小压0.4 s，等待10 s；所述第一大压的方法为：大压6 s。

12、进一步地，所述第三小压的方法为：等待3 s，小压0.2 s，等待10 s，小压0.3 s，等待10 s，小压0.2 s，等待（wait）6 s。

13、进一步地，所述第四小压的方法为：等待3 s，小压0.2 s，等待12 s，小压0.3 s，等待12 s，小压0.3 s，等待10 s；所述第二大压的方法为大压6 s。

14、进一步地，所述第五小压的方法为：小压0.4 s，等待8 s，小压0.6 s，等待10 s，小压0.4 s，等待6 s。

15、进一步地，所述第六小压的方法为：小压0.4 s，等待10 s，小压0.6 s，等待10 s，小压0.6 s，等待8 s；所述第三大压的方法为大压6 s。

16、进一步地，所述第七小压的方法为：等待3 s，小压0.4 s，等待6 s，小压0.4 s，等待8 s，小压0.3 s，等待4 s。

17、进一步地，所述第八小压的方法为：等待3 s，小压0.4 s，等待6 s，小压0.4 s，等待8 s，小压0.5 s，等待8 s；所述第三大压的方法为：大压6 s。

18、进一步地，所述第一清洗的方法为：使用无水乙腈清洗固相载体合成柱，进行第九小压和第四大压；所述第二清洗的方法为：使用无水乙腈清洗固相载体合成柱，进行第十小压和第五大压，一共清洗2次；

19、更进一步地，所述第九小压和第十小压的方法均为小压1 s，等待2 s；所述第四大压和第五大压的方法均为大压6 s。

20、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：相比于目前的常规合成程序中每一步骤试剂反应都必须吹干试剂，以保证载体干燥不参与下一步反应，本发明调整了程序：在同一种试剂反应时，前一步试剂可以删除吹干流程（即大压），并整体减少加入试剂量与反应时间，通过微调小压（保证最后小压后有少量试剂保留在固相载体上）达到同样合成效率与合成质量的目的。