一种高灵敏度氨苯砜单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于免疫检测，具体涉及一种高灵敏度氨苯砜单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、氨苯砜（dapsone，化学名称：4,4′-二氨基二苯砜）属于磺胺类合成抗菌药物，具有抑菌和抗炎作用，广泛应用于麻风病、疱疹样皮炎、卡氏肺孢子虫肺炎等疾病的临床治疗。在兽医领域，氨苯砜因其广谱抗菌活性和良好的组织渗透性，被用于治疗家禽、家畜的细菌性感染和球虫病等寄生虫疾病。然而，氨苯砜在动物体内的代谢较为缓慢，具有一定的蓄积毒性，长期使用或不当使用可能导致其在动物源性食品（如肉类、禽蛋、奶制品）中形成残留。人类长期摄入含氨苯砜残留的食品，可能引起高铁血红蛋白血症、溶血性贫血、肝损伤及神经系统损害等毒副作用。因此，包括中国在内的多个国家和地区均对动物源性食品中氨苯砜的最高残留限量做出了严格规定。

2、目前，氨苯砜残留的主要检测方法为高效液相色谱法（hplc）、液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）和气相色谱-质谱联用法（gc-ms）等仪器分析方法。这些方法虽然准确性和灵敏度高，但通常需要昂贵的仪器设备、专业的操作人员、复杂的样品前处理流程，检测成本高、耗时长，难以满足大规模样本的现场快速筛查需求。相比之下，免疫学检测方法，特别是基于单克隆抗体的酶联免疫吸附测定法（elisa）和胶体金免疫层析试纸条法，具有快速、简便、成本低、适合大批量筛查等优点，已成为兽药残留检测领域的重要技术方向。

3、针对氨苯砜的免疫检测，现有技术已有一些研究和报道。部分文献报道了抗氨苯砜单克隆抗体的制备，并建立了相应的免疫检测方法。然而，上述现有技术均未公开所获抗体的具体cdr序列或可变区氨基酸及核苷酸序列，本领域技术人员无法根据其公开内容直接获得具有相同性能的抗体，亦难以进行后续的抗体工程改造与规模化生产应用。此外，氨苯砜属于小分子半抗原（分子量约248 da），其本身不具备免疫原性，必须与载体蛋白偶联后才能诱导机体产生特异性抗体。半抗原的分子结构设计、连接臂的长度和位点选择直接影响偶联物中氨苯砜特征结构的暴露程度，进而决定所诱导抗体的灵敏度和特异性。

4、综上，现有技术中仍存在以下不足：一方面，缺乏一种灵敏度高、序列明确且可通过基因工程手段稳定批量生产的氨苯砜单克隆抗体；另一方面，现有公开的氨苯砜抗体相关技术中，均未提供抗体的cdr或可变区序列信息，限制了本领域技术人员根据其公开内容进行抗体工程改造及检测试剂开发。因此，开发一种灵敏度高、特异性良好、序列明确且适用于免疫检测的氨苯砜单克隆抗体及相应的检测产品，对于保障动物源性食品安全、加强氨苯砜残留监控具有重要的现实意义和应用价值。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高灵敏度氨苯砜单克隆抗体及其应用。本发明通过氨苯砜-载体蛋白偶联物免疫小鼠，经细胞融合和筛选，获得能够稳定分泌抗氨苯砜单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进一步提供了该抗体的cdr序列及可变区全长序列。基于该抗体开发的免疫检测试剂可用于动物源性食品中氨苯砜残留的快速、灵敏检测。

2、第一方面，一种高灵敏度氨苯砜单克隆抗体， 所述抗体由氨苯砜-载体蛋白免疫原免疫动物制备得到，能够特异性识别氨苯砜。

3、进一步地，所述氨苯砜单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括3个互补决定区（cdr）：轻链互补决定区cdr1、轻链互补决定区cdr2、轻链互补决定区cdr3；所述重链可变区包括3个互补决定区（cdr）：重链互补决定区cdr1、重链互补决定区cdr2、重链互补决定区cdr3。

4、具体地：

5、所述轻链互补决定区cdr1的氨基酸序列如seq id no. 18所示；

6、所述轻链互补决定区cdr2的氨基酸序列为qgt；

7、所述轻链互补决定区cdr3的氨基酸序列如seq id no. 21所示；

8、所述重链互补决定区cdr1的氨基酸序列如seq id no. 2所示；

9、所述重链互补决定区cdr2的氨基酸序列如seq id no. 4所示；

10、所述重链互补决定区cdr3的氨基酸序列如seq id no. 6所示。

11、优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no. 23所示；所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no. 8所示。

12、更优选地，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no. 30所示；编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no. 16所示。

13、第二方面，本发明提供了上述氨苯砜单克隆抗体的制备方法， 包括动物免疫、细胞融合与筛选、克隆化和腹水制备等步骤。

14、第三方面，本发明提供了所述氨苯砜单克隆抗体的应用， 包括将其用于制备氨苯砜检测试剂或检测试剂盒。具体地，一种用于检测氨苯砜的酶联免疫检测试剂盒，其包含本发明所述的氨苯砜单克隆抗体。所述试剂盒还包括：包被有氨苯砜-载体蛋白偶联物的酶标板、酶标记的抗鼠igg二抗、显色底物和洗涤液。优选地，所述氨苯砜-载体蛋白偶联物为氨苯砜-bsa或氨苯砜-ova。

15、本发明的有益效果是：

16、1、本发明提供的氨苯砜单克隆抗体针对氨苯砜的半数抑制浓度（ic50）为0.3-0.7ng/ml（典型值为0.5 ng/ml），表现出优异的灵敏度，能够满足动物源性食品中氨苯砜残留的严格检测要求；

17、2、该抗体与磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑等其他常见药物无交叉反应（交叉反应率<0.1%），保证了检测结果的特异性；

18、3、本发明完整公开了该抗体的轻链可变区、重链可变区及其互补决定区（cdr）的氨基酸序列和编码核苷酸序列，为相关领域的抗体工程改造及检测试剂开发提供了明确的序列资源，本领域技术人员可据此通过基因工程手段实现该抗体的体外重组表达与批量生产，克服了传统杂交瘤抗体传代不稳定及依赖活体动物制备的局限性。基于该抗体开发的酶联免疫检测试剂盒，操作简便、检测快速、灵敏度高，适用于动物源性食品中氨苯砜残留的批量样本筛查。

19、综上，本发明为氨苯砜残留的快速检测提供了一种灵敏度高、特异性强、序列明确且适用于批量检测的技术方案，具有良好的应用前景。

1.一种高灵敏度氨苯砜单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括3个互补决定区：轻链互补决定区cdr1、轻链互补决定区cdr2、轻链互补决定区cdr3；所述重链可变区包括3个互补决定区：重链互补决定区cdr1、重链互补决定区cdr2、重链互补决定区cdr3；

2.根据权利要求1所述的高灵敏度氨苯砜单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no. 23所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no. 8所示。

3.根据权利要求2所述的高灵敏度氨苯砜单克隆抗体，其特征在于：编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no. 30所示，编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no.16所示。

4.一种用于检测氨苯砜的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的高灵敏度氨苯砜单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的用于检测氨苯砜的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：包被有氨苯砜-载体蛋白偶联物的酶标板、酶标记的抗鼠igg二抗、显色底物和洗涤液。

6.根据权利要求5所述的用于检测氨苯砜的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述氨苯砜-载体蛋白偶联物为氨苯砜-bsa或氨苯砜-ova。

7.权利要求1-3任一项所述的高灵敏度氨苯砜单克隆抗体在制备用于检测氨苯砜残留的检测试剂中的应用。

8.权利要求1-3任一项所述的高灵敏度氨苯砜单克隆抗体在制备用于检测氨苯砜残留的生物传感器中的应用。