TGF-β疫苗的制作方法

本发明涉及衍生自转化生长因子β1（tgfβ1；tgfb1）的新的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸和包含这种肽的组合物。本发明还涉及该多肽、多核苷酸和组合物的用途和使用方法。

背景技术：

1、tgfb为一种多功能细胞因子，在免疫系统的调节中起关键作用。有四种亚型，其中亚型1（tgfb1）在t细胞免疫中特别重要。在癌症的情况下，tgfb1解除各种免疫细胞，如细胞毒性t细胞（ctl）、肿瘤相关的中性粒细胞和自然杀伤（nk）细胞的戒备。它还有助于肿瘤血管化和转移。因此，tgfb1为肿瘤微环境（tme）中的关键抑制分子，有助于下调免疫系统的抗肿瘤机制并使癌细胞能够逃避免疫。

2、在对转移性肝癌小鼠模型的最近研究中，tgfb1也已被认为有助于降低诸如pd-l1阻滞剂的免疫检查点阻滞剂（icb）的癌症治疗效率。

技术实现思路

1、本发明的多肽预期在刺激针对表达tgfb1的细胞的有益免疫应答方面特别有效。新的癌症免疫疗法的开发需要对参与发病机理的分子以及被免疫系统识别的特定蛋白质的透彻了解。在临床环境中，tgfb1特异性免疫应答的诱导可以直接杀死表达tgfb1的癌细胞，但更重要的是它通常通过抑制tgfb1的免疫抑制功能支持抗癌免疫应答。例如通过用本发明的多肽进行疫苗接种，靶向tgfb1和表达tgfb1的细胞将因此与另外的抗癌免疫疗法（如免疫检查点阻滞剂（icb））具有高度的协同作用。

2、tgfb1为一种二聚的细胞因子，其共享一个通过分子内二硫键连接在一起的半胱氨酸结结构。tgfb1合成为单体的390个氨基酸的前体蛋白，其可互换地称为：tgfb1前蛋白（pre-protein）；tgfb1前体；全长tgfb1；前-原-tgfb1。tgfb1前蛋白的全长序列作为seq idno: 1提供。

3、tgfb1前蛋白单体具有约25 kda的分子量。tgfb1蛋白单体具有三个不同的结构域：信号肽（sp：氨基酸1-29；seq id no: 2）、潜在相关肽（lap：氨基酸30-278；seq id no:3）和成熟肽（成熟tgfb1：氨基酸279-390；seq id no: 4），如图1e所示。

4、tgfb1 sp将蛋白质靶向分泌途径；sp在粗面内质网中被裂解。包含lap和成熟tgfb1的tgfb1单体可以在内质网中通过lap中半胱氨酸残基（例如cys 223和cys 225）和成熟tgfb1肽中半胱氨酸残基（例如cys 356）之间的二硫键二聚化，形成tgfb1同源二聚体。这种tgfb1同源二聚体被称为小潜在复合体（slc）。slc可以与所谓的潜在tgf-β结合蛋白（ltbp）结合以形成更大的复合物，其称为大潜在复合物（llc）。llc可以分泌到细胞外培养基（ecm）中。然而，lap和ltbp的存在阻止tgfb1结合至并激活其细胞外受体。活性tgfb1由成熟tgfb1肽的同源二聚体组成。成熟tgfb1同源二聚体从lap和ltbp释放的机制有多种，包括蛋白酶降解lap，通过与血小板反应蛋白相互作用诱导lap中的构象变化，以及lap和tgfβ-1之间的非共价键断裂。

5、本发明的目的是开发用于从tme中去除tgfb1的t细胞介导机制。本发明人通过筛选来自健康供体和癌症患者的pbmc研究了体内自发性tgfb1特异性t细胞应答的存在。然后分离、扩增tgfb1特异性t细胞群体，并且通过有关hla限制、细胞因子产生和细胞毒性的各种测定进行表征。

6、本发明人已经鉴定了具有最大免疫原性的人tgfb1区域。令人惊讶的是，这些免疫原性“热点”区域位于整个人类tgfb1前蛋白，包括在sp和lap结构域以及成熟的tgfb1肽内。本发明人还鉴定了人tgfb1 lap内的亚区域，即seq id no: 1的第121-160位（对应于seqid no: 65的序列），其含有更高频率的免疫原性肽序列。

7、因此，本发明提供了一种多肽，其为人tgfb1（seq id no: 1）的免疫原性片段，并且其包含seq id no: 1的至少9个连续氨基酸的序列，或由seq id no: 1的至少9个连续氨基酸的序列组成。seq id no: 1的至少9个连续氨基酸的序列可以对应于seq id no: 2或65的至少9个连续氨基酸的序列。所述多肽可以包含seq id no: 1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸，或由seq id no: 1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。所述多肽可以包含seq id no: 6、42、12、23、28、49、55、63、7-9、43-45、13-15、24-26、29-31、50-52、56-58、64、65、2、66、67或5中任一个的氨基酸序列，或由seq id no: 6、42、12、23、28、49、55、63、7-9、43-45、13-15、24-26、29-31、50-52、56-58、64、65、2、66、67或5中任一个的氨基酸序列组成；优选地，所述多肽包含seq id no: 6、42、12、23、28、49、55、63、66、67或5中任一个的氨基酸序列，或由seq idno: 6、42、12、23、28、49、55、63、66、67或5中任一个的氨基酸序列组成。所述多肽可以包含seq id no: 66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列，或由seq id no: 66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列组成；优选地，所述多肽包含seq id no: 66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列，或由seq id no: 66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列组成。

8、所述多肽可以具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸的最大长度。所述多肽的c端氨基酸可以被相应的酰胺替换。所述多肽可以包含hla-a2限制性表位。所述hla-a2限制性表位可以包含seq idno: 66或67的氨基酸序列或由seq id no: 66或67的氨基酸序列组成。

9、本发明还提供了一种编码本发明的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸可以是分离的。本发明还提供了包含所述多核苷酸的媒介（vector）。

10、本发明还提供了一种组合物，包含：本发明的多肽和/或本发明的多核苷酸，以及任选的佐剂。所述组合物还可以包含：至少一种不同的本发明的多肽；至少一种不同的本发明的多核苷酸；和/或至少一种药学上可接受的稀释剂、载体（carrier）或防腐剂。所述佐剂可以选自由基于细菌dna的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsrna的佐剂、咪唑喹啉（imidazochiniline）和montanide isa佐剂组成的组。

11、本发明还提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用本发明的多肽、本发明的多核苷酸、和/或本发明的组合物。所述方法还可以包括同时或依次施用另外的癌症疗法，优选抗体。

12、本发明还提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的组合物或它们的组合在治疗或预防疾病或病症中的用途。本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的组合物或它们的组合可以与另外的癌症疗法，优选抗体联合使用。

13、本发明还提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的组合物或它们的组合在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。

14、所述疾病或病症可以至少部分地以表达tgfb1的细胞的不适当的或过度的免疫抑制功能为特征，和/或其中所述疾病或病症为癌症。所述疾病或病症可以至少部分地以白细胞介素-4（il-4）和/或白细胞介素-13（il-13）的不适当的或过度的表达为特征。所述疾病或病症可以是癌症。所述癌症可以是乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌（如非小细胞肺癌（nsclc））、黑色素瘤、白血病（如急性骨髓性白血病（aml））或前列腺癌。

15、本发明还提供了一种刺激tgfb1特异性t细胞的方法，所述方法包括将t细胞与本发明的多肽和/或包含至少一种本发明的多肽的本发明的组合物接触。所述t细胞可以存在于取自健康受试者或癌症患者的样本中，任选地为肿瘤样本。