一种介导CRISPR-Cas基因编辑工具递送的多肽载体的制作方法

本发明涉及基因编辑，具体涉及一种介导crispr-cas基因编辑工具递送的多肽载体。

背景技术：

1、crispr-cas系统作为一种强大的基因编辑工具，在基因功能研究、疾病基因治疗等领域展现出广阔的应用前景。当前递送crispr-cas系统的方法主要包括病毒载体、非病毒载体、物理方法和化学方法。病毒载体如腺相关病毒（aav）、慢病毒（lentivirus）、腺病毒（adenovirus），能够高效感染、可靶向特定细胞类型，但是aav的包装容量有限（~4.7 kb），难以容纳较大的crispr-cas系统（如spcas9），并且可能引发宿主的免疫反应，影响递送效率，还有插入突变风险；非病毒载体如脂质体、纳米颗粒、聚合物载体具有安全性较高，无插入突变风险的优点，但是递送效率低。相比病毒载体，非病毒载体的递送效率通常较低且靶向性和稳定性差；常用的物理方法如电穿孔、显微注射、基因枪等，可直接、高效在体外递送crispr-cas系统，但是会对细胞造成损伤，影响细胞存活率且不适用于体内，难以应用于活体组织或动物模型。因此，目前用于递送crispr-cas系统至靶细胞的现有技术均存在一定缺陷，如病毒载体包装容量有限、细胞毒性较高、免疫原性高以及原代细胞递送效率低等，严重制约了crispr-cas系统在基因治疗等临床应用中的推广。

2、为了克服上述问题，研究人员提出了以多肽为载体递送crispr-cas系统的新型方法。与病毒载体相比，多肽载体具有生物相容性好、细胞毒性低、制备简单等优势，有望提高crispr-cas系统的递送安全性和高效性。但是，现有的多肽载体在递送crispr-cas系统时，仍然存在一定局限性，如载体与crispr-cas系统的结合不够稳定、细胞内释放效率较低等，影响了基因编辑的效果。因此，亟需开发一种新型的多肽载体crispr-cas递送系统，以进一步提高crispr-cas系统在基因编辑领域的应用效率和安全性，为基因治疗、疾病模型构建等提供有力支撑。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种多肽及其应用，所述多肽能够辅助crispr-cas基因编辑系统中的cas蛋白及其与sgrna或crrna的核糖核蛋白复合物（rnp）递送入目的细胞中，对细胞造成的损害减少，且几乎不影响细胞的固有特性和状态；操作流程简单迅速；同时具备较低成本优势。

2、为此，本发明第一方面提供一种多肽。根据本发明的实施方案，所述多肽包括细胞穿透肽和抗菌肽（amp）氨基酸序列，所述细胞穿透肽的c端与所述抗菌肽氨基酸序列的n端相连；或者，

3、所述抗菌肽氨基酸序列的c端与所述细胞穿透肽的n端相连；

4、其中，所述抗菌肽氨基酸序列如seq id no: 1-19所示，或者为具有seq id no:1-19所示氨基酸序列相同功能的衍生序列。

5、发明人发现一种多肽，其包括细胞穿透肽和抗菌肽氨基酸序列，该多肽能够辅助crispr-cas基因编辑系统中的cas蛋白及其与sgrna或crrna的核糖核蛋白复合物（rnp）递送入目的细胞中，对细胞造成的损害减少，且几乎不影响细胞的固有特性和状态。

6、在本发明的一些实施方案中，所述细胞穿透肽包括选自tat、(arg)9、penetratin、gala、lah4中的至少之一。

7、当所述细胞穿透肽为tat、(arg)9、penetratin、gala、lah4中的至少之一时，其与抗菌肽组成的多肽能够辅助crispr-cas基因编辑系统中的cas蛋白及其与sgrna或crrna的核糖核蛋白复合物（rnp）递送入目的细胞中，对细胞造成的损害减少，且几乎不影响细胞的固有特性和状态。

8、在本发明的一些实施方案中，所述细胞穿透肽为tat或(arg)9。

9、在本发明的一些实施方案中，所述tat的氨基酸序列如seq id no: 24、seq idno: 25所示，或者为具有seq id no: 24、seq id no: 25所示氨基酸序列相同功能的衍生序列。

10、在本发明的一些实施方案中，所述(arg)9的氨基酸序列如seq id no: 30所示，或者为具有seq id no: 30所示氨基酸序列相同功能的衍生序列。

11、在本发明的一些实施方案中，所述细胞穿透肽和/或抗菌肽氨基酸序列中的至少一个氨基酸是d型氨基酸。

12、在本发明的一些实施方案中，所述细胞穿透肽和/或抗菌肽氨基酸序列未经修饰或者被化学修饰。

13、在本发明的一些实施方案中，所述化学修饰包括c端氨基酸的酰胺化、硫酸酯化；n端氨基酸的乙酰化、脂肪酸化；中间残基丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬酰氨中至少之一的糖基化修饰；中间残基丝氨酸、酪氨酸、色氨酸中至少之一的磷酸化修饰；环化修饰；聚乙二醇化修饰。

14、发明人发现，对所述细胞穿透肽和/或抗菌肽氨基酸序列进行上述的化学修饰，这样的多肽能够辅助crispr-cas基因编辑系统中的cas蛋白及其与sgrna或crrna的核糖核蛋白复合物（rnp）递送入目的细胞中，对细胞造成的损害减少，且几乎不影响细胞的固有特性和状态。

15、在本发明的一些实施方案中，在所述多肽中，所述tat或(arg)9的氨基酸序列的c端直接与所述抗菌肽氨基酸序列的n端相连；或者，

16、所述抗菌肽氨基酸序列的c端直接与tat或(arg)9的氨基酸序列的n端相连。

17、在本发明的一些实施方案中，所述tat氨基酸序列如seq id no: 24或seq id no:25所示；所述(arg)9的氨基酸序列如seq id no: 30所示。

18、在本发明的一些实施方案中，所述抗菌肽氨基酸序列如seq id no: 4、seq idno: 5、seq id no: 9、seq id no: 10、seq id no: 12、seq id no: 17、seq id no: 18所示。

19、在本发明的一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如seq id no: 34、seq idno: 36、seq id no: 37、seq id no: 38所示。本发明第二方面提供第一方面所述的多肽在提升crispr/cas系统的基因编辑效率中的用途。

20、在本发明的一些实施方案中，所述crispr/cas系统涉及的cas蛋白为crispr系统效应蛋白。

21、在本发明的一些实施方案中，所述crispr系统效应蛋白包括选自cas12a、cas9、cas13、cas3、cas8、csel、csyl、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5和fokl中的一种或多种。

22、本发明第三方面提供第一方面所述的多肽在制备提升crispr/cas系统的基因编辑效率的试剂或试剂盒中的用途。

23、在本发明的一些实施方案中，所述crispr/cas系统涉及的cas蛋白为crispr系统效应蛋白。

24、在本发明的一些实施方案中，所述crispr系统效应蛋白包括选自cas12a、cas9、cas13、cas3、cas8、csel、csyl、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5和fokl中的一种或多种。

25、本发明第四方面提供一种用于提升crispr/cas系统的基因编辑效率的试剂或试剂盒。在本发明的一些实施方案中，所述试剂或试剂盒包括第一方面所述的多肽。

26、本发明第五方面提供一种用于提升crispr/cas系统的基因编辑效率的方法。在本发明的一些实施方案中，所述方法包括：

27、将第一方面所述的多肽以及递送货物进行混合，导入目的细胞，

28、其中，所述递送货物包括：

29、靶向目标基因的sgrna或crrna以及crispr系统效应蛋白的复合物，或者crispr系统效应蛋白本身。

30、在本发明的一些实施方案中，所述crispr系统效应蛋白包括选自cas12a、cas9、cas13、cas3、cas8、csel、csyl、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5和fokl中的一种或多种。

31、本发明第六方面提供一种融合蛋白。在本发明的一些实施方案中，所述融合蛋白包括至少一个第一方面所述的多肽的氨基酸序列。

32、在本发明的一些实施方案中，所述多肽的c端与crispr系统效应蛋白的n端相连；或者，

33、所述多肽的n端与crispr系统效应蛋白的c端相连。

34、在本发明的一些实施方案中，所述crispr系统效应蛋白包括选自cas12a、cas9、cas13、cas3、cas8、csel、csyl、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5和fokl中的一种或多种。

35、本发明第七方面提供一种核酸分子。在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子编码第六方面所述的融合蛋白。

36、本发明第八方面提供一种表达载体。在本发明的一些实施方案中，所述表达载体包含第七方面所述的核酸分子。

37、本发明第九方面提供一种重组病毒。在本发明的一些实施方案中，所述重组病毒包含第八方面所述的表达载体，所述重组病毒能够侵染目的细胞。

38、相较于现行技术，本发明提供的多肽，能够在使用更少细胞数量的情况下，在大部分细胞类型（如el4、thp-1、jurkat），甚至是操作复杂度较高的人类原代t细胞中实现较高的编辑效果；对细胞造成的损害减少，且几乎不影响细胞的固有特性和状态；操作流程简单迅速；同时具备较低成本优势。

39、利用本发明的多肽能够提升细胞系和原代细胞的高效、低毒性、低扰动的基因编辑效率。本发明还提供一种提升crispr/cas系统的基因编辑效率的方法，相比于现有方法，操作的简便性大幅提高，实验周期大幅缩短。另外，本发明还建立了抗菌肽载体序列的构建原则。

40、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。