一种用于鸭性别鉴定的引物及方法

本发明涉及生物检测的，具体地，涉及一种用于鸭性别鉴定的引物及方法。

背景技术：

1、鸭是我国重要的水禽养殖品种，在肉鸭、蛋鸭及种鸭产业中均占有重要地位。在鸭的养殖过程中，早期性别鉴定对于提高养殖效益、优化种群结构具有重要意义。例如，在肉鸭生产中，公鸭与母鸭的生长速度和饲料转化率存在显著差异，早期分群饲养可实现精准营养调控；在种鸭选育中，及时鉴别雏鸭性别有助于缩短选育周期、提高核心群建群效率；在分子育种领域，准确的性别信息是开展性别相关性状遗传分析的前提。因此，建立一种快速、准确、低成本且适用于基层推广的鸭性别鉴定技术，对于推动鸭产业的现代化发展具有重要意义。

2、目前，鸭性别鉴定主要依赖于传统的人工翻肛鉴别法和基于分子生物学的pcr检测法。传统翻肛鉴别法主要通过观察雏鸭泄殖腔的形态特征来判断性别，该方法虽然无需特殊设备，但存在明显不足：一是对操作人员的技术水平和经验要求极高，鉴别准确率受人为因素影响大，在大规模生产中误差率较高，可能导致严重的经济损失；二是操作过程易对雏鸭造成应激和机械损伤，影响后续生长发育；三是仅适用于出壳后较短时间内的雏鸭，无法对成年鸭进行性别鉴定，应用范围受限。

3、随着分子生物学技术的发展，基于性染色体差异的pcr性别鉴定方法逐渐成为研究热点。鸟类性别决定系统为zw型，雌性为zw，雄性为zz。染色体螺旋蛋白dna结合蛋白1（chromo-helicase-dna-binding protein 1，chd1）基因位于z和w性染色体上，由于z染色体与w染色体上的chd1基因在内含子区域存在长度多态性，因此可通过pcr扩增结合琼脂糖凝胶电泳进行性别判定。雌性个体（zw）可同时扩增出chd1-z和chd1-w两条条带，而雄性个体（zz）仅扩增出chd1-z单一条带。chd1基因因其高度保守性，已被广泛应用于多种鸟类的分子性别鉴定。

4、然而，现有的基于chd1基因的pcr性别鉴定技术在鸭实际应用中仍存在以下问题：

5、（1）现有通用引物对鸭的适用性有待提高。目前常用的鸟类性别鉴定引物（如p2/p8、2550f/2718r等）虽然在多种鸟类中具有通用性，但在鸭中的扩增效果不稳定。有研究发现，经典引物p2/p8、1237l/1272h和2550f/2718r在鸭性别鉴定中存在缺陷，为此专门设计了hpf/hpr引物用于鸭的性别鉴定（pmid：25895514）；刘宏祥等人也设计了gchd通用引物用于主要禽类的性别鉴定（刘宏祥,胡艳,姬改革,等.快速鉴定主要禽类性别的一对新的通用引物[j].农业生物技术学报,2014,22(12):1567-1574.）。然而，这些引物在鸭不同品种中的扩增效率和特异性仍有提升空间，可能导致扩增效率低、条带不清晰或出现非特异性扩增，影响鉴定结果的准确性。

6、（2）现有方法的靶点局限于已知基因。自1996年ellegren首次将chd1基因定位于w染色体以来，近30年间鸟类分子性别鉴定方法的靶点始终集中在已知基因（如chd1、spin、nipbl、rasa1等）的编码区或内含子序列上。kroczak等在提出多标记策略时，所采用的所有标记仍为基因内序列。然而，已知基因的内含子长度多态性在不同鸟类类群中差异较大，部分物种中z/w染色体间的长度差异较小（通常为120～180 bp），导致电泳判读困难。此外，基因编码区受功能约束，序列变异空间有限。相比之下，性染色体上的基因间区（intergenicregion）序列不受编码功能约束，进化速度与基因内含子不同，可能存在更大范围的长度多态性，为开发新的性别特异性标记提供了尚未被利用的序列空间。然而，基因间区长期被视作不具备功能的“垃圾dna”，研究人员很少能从中筛选到适合用于性别鉴定的分子标记。

7、因此，亟需开发一种引物特异性强、样品前处理简便、检测成本低、适用于基层推广的鸭性别鉴定方法，以满足鸭早期性别鉴定、种鸭选育及分子育种等领域的实际需求。

技术实现思路

1、为克服现有技术中存在的上述缺陷与不足，本发明提供一种用于鸭性别鉴定的引物及方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于鸭性别鉴定的引物组。

3、本发明的第二个目的是提供一种用于鸭性别鉴定的试剂盒。

4、本发明的第三个目的是提供上述的引物组和/或试剂盒在鸭性别鉴定或制备鸭性别鉴定的产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供上述的引物组和/或试剂盒在种鸭选育和/或鸭分子辅助育种中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种鸭性别鉴定的方法。

7、本发明的第六个目的是提供上述的方法在种鸭选育和/或鸭分子辅助育种中的应用。

8、本发明要求保护以下内容：

9、一种用于鸭性别鉴定的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no：3～5所示的引物。

10、一种用于鸭性别鉴定的试剂盒，包括上述的引物组。

11、优选地，所述试剂盒还包括dna提取试剂和/或pcr扩增试剂。

12、作为一种可实施的方式，所述dna提取试剂包括氢氧化钠裂解液和/或te缓冲液。

13、作为一种可实施的方式，所述pcr扩增试剂包括pcr预混液和/或ddh2o。

14、上述的引物组和/或试剂盒在鸭性别鉴定或制备鸭性别鉴定的产品中的应用。

15、优选地，所述鸭为家鸭。

16、更优选地，所述鸭包括绍兴鸭、奉化水鸭和/或缙云麻鸭。

17、优选地，所述鸭性别鉴定为：使用引物组或试剂盒对待测鸭样品进行pcr扩增，pcr扩增产物经电泳检测只有一条446 bp的条带，判定为公鸭；

18、pcr扩增产物经电泳检测呈现446 bp和237 bp的两个条带，或只有一条237 bp的条带，判定为母鸭。

19、作为一种可实施的方式，所述待测鸭样品包括组织或含羽髓的羽毛。

20、上述的引物组和/或试剂盒在种鸭选育和/或鸭分子辅助育种中的应用。

21、优选地，所述分子辅助育种为性别的分子辅助育种。

22、一种鸭性别鉴定的方法，包括以下步骤：

23、以待测鸭的基因组dna为模板，使用上述的引物组进行pcr扩增，pcr扩增产物经电泳检测只有一条446 bp的条带，判定为公鸭；

24、pcr扩增产物经电泳检测呈现446 bp和237 bp的两个条带，或只有一条237 bp的条带，判定为母鸭。

25、优选地，所述pcr扩增的体系包含pcr预混液6～6.5 μl，核苷酸序列如seq id no：3所示的引物0.3～0.7 μl，核苷酸序列如seq id no：4和seq id no：5所示的引物各0.2～0.3 μl，待测鸭的基因组dna 0.5～1.5 μl，超纯水4～4.5 μl。

26、更优选地，所述pcr扩增的体系包含pcr预混液6.25 μl，核苷酸序列如seq id no：3所示的引物0.5 μl，核苷酸序列如seq id no：4和seq id no：5所示的引物各0.25 μl，待测鸭的基因组dna 1 μl，超纯水4.25 μl。

27、优选地，所述pcr扩增的程序为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。

28、上述的方法在种鸭选育和/或鸭分子辅助育种中的应用。

29、优选地，所述分子辅助育种为性别的分子辅助育种。

30、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

31、本发明提供了一种用于鸭性别鉴定的引物及方法。本发明在鸭的性染色体基因间区上发现一段高度保守的候选序列，针对该候选序列设计了核苷酸序列如seq id no：3～5所示的引物。本发明的引物对多种鸭均表现出良好的扩增效率，性别鉴定结果准确，克服了现有通用引物在鸭中扩增效果不稳定的缺陷。同时，本发明的引物能够以刚出生雏鸭和成年鸭的羽毛以及胚胎组织为样品来源，适用于从胚胎期到成年期的各个发育阶段。此外，本发明的性别鉴定方法操作简便，检测时间短，检测成本低，在基层实验室和养殖现场的鸭性别鉴定中具有广阔的应用前景。