用于治疗GNE肌病的基于AAV的基因治疗剂的制作方法

本技术涉及基因疗法技术、下一代生物制药，更具体地，涉及用于治疗gne肌病(gnem)的基于aav的基因疗法。本技术要求于2024年3月20日提交的韩国专利申请号10-2024-0038584和于2024年11月15日提交的韩国专利申请号10-2024-0163342的权益，其公开内容通过引用并入本文。

背景技术：

1、gne肌病(gnem)是一种与gne基因突变相关的遗传性肌肉疾病。gnem是一种罕见的、目前无法治愈的疾病，其特征在于进行性肌肉退化，通常始于远端肌肉，并可扩展至全身。在gnem患者中，gne酶活性降低通常与唾液酸生物合成减少相关，并且这种减少被认为是导致肌肉损失的主要因素。gnem平均发生在20岁至40岁的人群中，初始症状是胫骨前肌无力，导致足下垂，难以抬起脚踝，以及脚趾拖曳和步态异常。随着疾病进展，姿势稳定性可能下降，这可能导致频繁跌倒，以及难以进行诸如跑步、爬楼梯和从坐姿站起等活动。在gnem中，与其他肢体肌肉相比，股四头肌可能相对不受肌肉受累影响，然而，上肢肌肉也可能受到影响，这可能导致日常生活活动受限。gnem在数十年间进展，颈部肌肉也可能受到影响，导致活动能力降低，并在晚期阶段，上下肢骨骼肌功能严重受损。

2、gne蛋白是一种称为udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶/n-乙酰甘露糖胺激酶的酶蛋白，其直接参与唾液酸的生物合成。gne蛋白由753个氨基酸组成，并包括两个功能结构域，即氨基葡萄糖(udp-n-乙酰)-2-差向异构酶结构域(从n末端到410位氨基酸的区域)和n-乙酰甘露糖胺激酶结构域(从411位氨基酸到c末端的区域)。gne基因的突变可能发生在编码上述两个功能结构域的dna序列内的各个位置，并且已报道降低gne酶活性的突变通过降低在肌肉细胞表面上表达的糖蛋白的唾液酸化水平而引起gnem症状。

3、目前尚无治愈gnem的方法，保守治疗侧重于症状。尽管在gnem早期诊断后定期进行物理治疗和管理可能减缓gnem的进展，但这不是一种可以根本性治疗由持续肌肉使用引起的患者肌肉萎缩的方法，并且在改善患者生活质量方面存在局限性。因此，正在尝试提供唾液酸生物合成途径中间体n-乙酰甘露糖胺(mannac)的方法，以及通过使用基因疗法诱导正常gne基因持续表达的方法，但仍不充分。

4、在此技术背景下，作为致力于开发用于治疗gnem的基于腺相关病毒(aav)载体的基因疗法的努力的结果，衍生出了具有改善的gne表达效率的新型遗传构建体，并且基于此，完成了本公开。

5、结果，根据本公开制备的用于治疗gnem的分离的核酸、包含其的表达盒、包含其的重组病毒或包含其的药物组合物，可用于下一代生物制药领域，并且可对应于一种创新新药，因为其是一种之前从未在gnem相关领域中使用的基因疗法。

技术实现思路

1、技术问题

2、一个方面是提供一种经工程化以增强gne蛋白的表达水平的分离的核酸。

3、另一方面是提供一种包含所述分离的核酸的表达盒。

4、另一方面是提供一种包含所述表达盒的基于腺相关病毒血清型9的重组病毒。

5、另一方面是提供一种用于预防或治疗gne肌病(gnem)的药物组合物，其包含含有所述分离的核酸的载体。

6、本技术的其他目的和优点将从以下详细描述以及所附权利要求和附图中变得显而易见。本文未描述的任何事项将被本技术领域或类似领域的普通技术人员充分认可和推断，因此省略其描述。

7、问题的解决方案

8、本技术中公开的每个描述和实施方式均可应用于其他描述和实施方式。因此，本技术中公开的各种元素的所有组合均落入本技术的范围内。此外，本技术的范围不应被认为受下文阐述的具体描述的限制。

9、一个方面是提供一种分离的核酸，其与seq id no: 2的核苷酸序列具有75%至99%的序列同一性，并且基于整个核苷酸序列的gc含量为50至60%。

10、如本文所用，术语“核酸”是指包含多个核苷酸单元的高分子物质，具体地，是其中多个核苷酸单元通过糖/磷酸骨架的磷酸二酯键相互连接的聚合物。所述核酸可与术语“多核苷酸”和“核酸分子”互换使用。核酸是生物体必需的生物聚合物，并且可以是rna或dna，优选为dna，其通过独特的核酸序列编码遗传信息。所述核酸是分离的、人工合成的或非天然存在的或经工程化的，其中“非天然存在的或经工程化的”指通过人工修饰产生的状态，而非天然状态下存在的状态。在此，人工修饰旨在改善gne蛋白的表达，并且可以包括密码子优化的gne蛋白的编码序列。

11、如本文所用，术语“分离的”核酸(例如，“分离的dna”)是指至少部分地与天然存在的生物体或病毒的其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或其他多肽)或通常发现与所述多核苷酸相关的核酸的至少一部分分离的多核苷酸。

12、如本文所用，术语“密码子优化的”指用于转化多种宿主的核酸分子的基因或编码区，并且指改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变由该dna编码的多肽。这种优化包括将至少一个、或一个或多个、或大量密码子替换为该生物体基因中更频繁使用的一个或多个密码子。

13、如本文所用，术语“gne(氨基葡萄糖(udp-n-乙酰)-2-差向异构酶/n-乙酰甘露糖胺激酶)蛋白”是一种参与唾液酸生物合成的酶，其负责从udp-glcnac到mannac以及从mannac到mannac6-磷酸的两种酶促反应。因此，gne基因突变导致唾液酸产生减少，从而导致各种糖蛋白(包括重要的肌肉蛋白，如α-抗肌萎缩相关糖蛋白(α-dystroglycan，α-dg)、神经细胞粘附分子(ncam)或脑啡肽酶)的唾液酸化降低，或导致其他基因如神经节苷脂(例如：gm3)合酶的表达降低，从而导致肌肉退行性变化。

14、在一个实施方式中，所述gne蛋白可以由seq id no: 1的氨基酸序列组成，并且编码所述gne蛋白的野生型gne基因可以由seq id no: 2的核苷酸序列组成。根据一个方面的分离的核酸可以旨在增强gne蛋白的表达，例如，用于在基于aav9的表达构建体下增强靶蛋白的表达，并且可以与seq id no: 2的核苷酸序列具有75%至99%的序列同一性，并且gc含量对应于基于整个核苷酸序列的50至60%的范围。

15、如本文所用，术语“同一性”指聚合物分子之间的整体相关性，例如，核酸之间(例如，dna分子和/或rna分子)和/或多肽之间。例如，如果多肽的氨基酸序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相同，则认为它们彼此“实质上相同”。计算两个核酸或多肽序列的百分比同一性可以例如通过为了最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，可以在第一和第二序列中的一个或两个中引入缺口以进行最佳比对，并且可以为了比较目的忽略非相同序列)。例如，用于比较目的的比对序列的长度为参考序列长度的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或基本100%。接下来，比较对应位置的核酸或多肽序列。确定两个序列之间的百分比同一性和比较序列可以使用数学算法来完成。如本领域普通技术人员所熟知的，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中可用的那些，例如用于核苷酸序列的blastn和用于氨基酸序列的blastp、gappedblast和psi-blast。

16、在一个实施方式中，所述分离的核酸可以与seq id no: 2的核苷酸序列具有75%至99%的序列同一性，例如，所述分离的核酸可以与seq id no: 2的核苷酸序列具有75%至99%、75%至95%、75%至90%、75%至85%、75%至80%、80%至99%、80%至95%、80%至90%、80%至85%、75%至80%、85%至99%、85%至95%、85%至90%或90%至95%的序列同一性。

17、如本文所用，术语“gc含量”指鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)在目标区域总碱基中的比率，已知gc含量越高，dna密度越高，越不易变性。

18、在一个实施方式中，所述分离的核酸的gc含量可以对应于基于整个核苷酸序列的50%至60%的范围，例如，所述分离的核酸的gc含量可以为50%至60%、50%至58%、50%至56%、50%至54%、50%至52%、52%至60%、52%至58%、52%至56%、52%至54%、54%至60%、54%至58%、54%至56%、56%至60%、56%至58%或58%至60%。

19、在一个实施方式中，分离的核酸可以满足以下条件：(a)编码由seq id no: 1的氨基酸序列表示的gne蛋白；(b)与seq id no: 2的核苷酸序列的序列同一性为75至80%；和(c)基于整个核苷酸序列的gc含量为55至58%。具体地，分离的核酸可以是选自由seq idno: 3的核苷酸序列、seq id no: 5的核苷酸序列和seq id no: 6的核苷酸序列组成的组中的任意一个。

20、根据一个实施方式，本公开的分离的核酸是基于野生型gne核苷酸序列进行修饰的，并且当所述分离的核酸作为转基因在表达盒中应用时，如图1所示，gne蛋白的表达水平可显著增强。

21、另一方面是提供一种包含所述分离的核酸的表达盒。

22、由于所述表达盒包含或利用上述分离的核酸，为了避免本说明书过于复杂，省略了它们之间的共同内容。

23、如本文所用，术语“表达盒”指包含表达靶蛋白所需元件的核酸构建体。具体地，其是指下述核酸构建体，所述核酸构建体包含至少包含启动子的表达控制序列，以及可操作地连接至所述表达控制序列的用于表达靶蛋白的核酸。

24、如本文所用，术语“表达控制序列”指对于在特定宿主生物体中表达与其可操作地连接的靶蛋白的编码序列所需的核酸序列。例如，已知使用适用于真核细胞的调控序列，如启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

25、如本文所用，术语“启动子”指控制一个或多个编码序列转录的核酸片段，并且相对于转录方向，位于编码序列的转录起始位点阅读方向的上游，其通过存在dna依赖性rna聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他核酸序列(例如但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域普通技术人员已知的直接或间接调节启动子转录水平的任何其他核苷酸序列)来结构性地鉴定。在哺乳动物细胞中起作用的任何启动子均示例为所述启动子，其实例为组成型表达启动子，如cmv启动子、sv40启动子、ef-1α启动子、cag启动子、pgk启动子、u3启动子、u6启动子、h1启动子等。除了这些启动子之外，已知的诱导型启动子、组织·器官特异性启动子、时期特异性启动子或具有其功能等同物的突变序列也可用于本公开中。

26、如本文所用，术语“增强子”可以指位于编码靶蛋白的序列附近的核酸序列。增强子元件通常位于启动子元件的5'方向，或者可以位于编码核酸序列(例如，转录或翻译成重组产物的dna序列)的下游或内部。即，增强子元件可以位于编码靶蛋白的核酸序列上游或下游100个碱基对(bp)、200bp或300bp或更多处。

27、在一个实施方式中，所述表达盒旨在增强基于aav9的表达构建体下靶蛋白的表达，并且可以包含或可以可操作地连接以下元件：第一反向末端重复序列(itr)；巨细胞病毒增强子；巨细胞病毒启动子；与seq id no: 2的核苷酸序列具有至少75%至99%序列同一性且基于整个核苷酸序列的gc含量对应于50至60%范围的分离的核酸；人生长激素基因1(hgh1)多腺苷酸化信号；和第二反向末端重复序列(itr)。

28、如本文所用，术语“可操作地连接”可以指核苷酸序列在单个核酸片段上连接，使得一个功能受另一个影响。

29、另一方面是提供一种包含所述表达盒的基于腺相关病毒血清型9(aav9)的重组病毒。

30、由于所述基于腺相关病毒血清型9的重组病毒包含或利用上述分离的核酸或表达盒，为了避免本说明书过于复杂，省略了它们之间的共同内容。

31、如本文所用，术语“腺相关病毒(aav)”指一种小的(26nm)、无包膜的细小病毒，具有约4.7kb的单链基因组，由于其高转导效率、持续的转基因表达和感染后的低致病性，已被强调作为用于疾病治疗的基因递送载体。然而，由于腺相关病毒也是一种病毒载体，像其他病毒载体一样，存在高剂量全身施用可能导致严重副作用的问题。腺相关病毒的血清型主要由aav衣壳蛋白的结构决定，由于不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，血清型的选择可能影响aav的感染效率、组织趋向性和表达启动时间。腺相关病毒的血清型包括，例如，aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12等。

32、如本文所用，术语“基于腺相关病毒血清型9的重组病毒”指封装在aav衣壳内的上述表达盒，并且可与术语“基于aav9的病毒样颗粒”、“aav9重组病毒株”、“aav9重组载体”或“raav9载体”互换使用。

33、根据一个实施方式，本公开的重组病毒引入有基于野生型gne核苷酸序列修饰的分离的核酸，或包含所述核酸的表达盒。可以将所述重组病毒引入细胞或在体内施用以增强gne蛋白的表达效率，从而增强肌肉中的唾液酸产生。此外，所述重组病毒可以显著增强gne蛋白的表达水平，从而通过减少治疗目标疾病的有效剂量，有助于减少因应用病毒载体而产生的副作用。

34、另一方面是提供一种用于预防或治疗gne肌病(gnem)的药物组合物，其包含作为活性成分的载体，所述载体包含选自由seq id no: 3的核苷酸序列、seq id no: 5的核苷酸序列和seq id no: 6的核苷酸序列组成的组中的任一分离的核酸，以及所述药物组合物用于预防或治疗gnem的药物用途。

35、由于用于预防或治疗gnem的药物组合物包含或利用上述分离的核酸或表达盒，为了避免本说明书过于复杂，省略了它们之间的共同内容。

36、如本文所用，术语“活性成分”指以充足有效量影响有益或期望的临床或生化结果的成分。具体地，可以指有效量的制剂、活性剂或重组病毒。所述有效量可以施用一次或多于一次，并且可以是足以预防疾病或(无限制地)减轻症状、减小疾病程度、稳定(换言之，不恶化)疾病状态、延迟或降低疾病进展速度、或改善或暂时(部分或完全地)缓解和减轻疾病状态的量。

37、如本文所用，术语“预防”指预先防止疾病发生、抑制疾病或延迟其进展的任何行为。例如，指预防肥胖或其特征性特征的发生、干扰其发生、或防御或保护免受gnem或其特征性特征的发生。

38、如本文所用，术语“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防范性方法。它还指改善或有益地改变疾病症状的任何行为。例如，在受试者中预防、减少或改善gnem或其特征性特征，或延迟(减轻)疾病或其特征性特征的进展。

39、如本文所用，术语“有效量”指本领域通常接受的含义。该术语通常可以指分子、化合物或组合物的量，其将在细胞、组织、系统、动物或人中引发研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻求的预期生物应答(例如：有益应答)。具体地，“治疗有效量”可以指分子、化合物或组合物的量，其引发期望的医学应答，例如与疾病或障碍相关的可测量参数的治疗相关变化，使得特定的临床治疗可被认为是有效的。用于治疗所述疾病或障碍的药物的治疗有效量可以是引起该参数的治疗相关变化所需的量。

40、“gne肌病”是待由上述药物组合物预防或治疗的疾病，是一种由gne基因突变引起的常染色体隐性遗传病，该基因产生称为udp-glcnac 2-差向异构酶/mannac激酶(gne)的酶，gne肌病也称为“远端肌病”、“nonaka肌病、股四头肌豁免型空泡性肌病(vacuolarmyopathy sparing the quadriceps femoris)、包涵体肌病2型(ibm2或hibm2)或gnem。目前，尚无治愈gnem的方法，治疗集中在症状的支持性护理，因此，需要多方面的方法来治疗该疾病。

41、在一个实施方式中，本公开涉及一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体或其他药物试剂、佐剂、稀释剂等中的基于aav9的重组病毒，所述基于aav9的重组病毒包含本公开的分离的核酸。对于注射或全身施用，载体通常将是液体载体。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体，例如，无菌无热原水或无菌无热原磷酸盐缓冲盐水溶液。作为注射介质，优选使用含有对于注射溶液常见的添加剂的水，例如稳定剂、盐或盐水、和/或缓冲剂。

42、所述药物组合物指包含本公开的基于aav9的重组病毒和选自药学上可接受的且药理学上适当的赋形剂(例如填充剂、溶剂、稀释剂、载体、佐剂、崩解剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂和长效递送调节剂)中的一种或多种组分的组合物，其中它们的选择和比例根据施用类型、途径和剂量确定。本公开的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员而言无疑将是显而易见的。药物组合物优选应符合良好生产规范(gmp)要求。所述组合物还可包含缓冲组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。

43、所述药物组合物可以以单个单位剂量或多个单单位剂量的形式，以即用制剂的形式广泛地制造、包装或销售。如本文所用，术语“单个单位剂量”指含有预定量活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常对应于待施用于受试者的活性成分的剂量，或该剂量的方便部分，例如，剂量的一半或三分之一。

44、一个方面提供了一种预防或治疗gnem的方法，包括向受试者施用所述药物组合物。

45、由于所述预防或治疗gnem的方法包含或利用上述药物组合物，为了避免本说明书过于复杂，省略了它们之间的共同内容。

46、如本文所用，术语“受试者”指需要治疗疾病，特别是gnem的目标，并且更具体地可以包括所有哺乳动物，如人类或非人灵长类动物、小鼠、犬、猫、马、牛、羊、猪、山羊、骆驼或羚羊。

47、发明的有益效果

48、根据一个方面的分离的核酸，以及包含所述分离的核酸的表达盒或基于aav9的重组病毒，可以在施用或引入其的受试者中诱导gne蛋白的高水平表达。

49、此外，根据一个方面的基于aav9的重组病毒可以由于优异的gne蛋白表达效率带来的效果而减少有效剂量，并且因此可以减轻因应用病毒载体而产生的副作用，从而有助于提高治疗gne肌病(gnem)的基因疗法的功效。