一种用于矫正IGH扩增偏好的标准品库、试剂盒和使用方法与流程

本发明涉及免疫组库测序，尤其涉及一种用于矫正igh扩增偏好的标准品库、试剂盒和使用方法。

背景技术：

1、微小残留病 (minimal residual disease, mrd) 是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤/实体瘤患者经治疗取得完全缓解(cr)后，体内仍残留少量癌细胞的状态(108-109)，可能会引起复发。因常规影像学无法检测，因此需要更准确和灵敏的方法去检测残留的癌细胞，当前nccn指南和专家共识推荐通过检测igh重排来实现淋系血液肿瘤的mrd检测。

2、目前，igh重排的检测方法有多色流式、pcr、ddpcr、ngs，国际推荐高通量测序（ngs）作为 mrd检测方法，其中ngs的检测灵敏度远高于流式，尤其在低于万分之一的肿瘤细胞占比下，ngs能够使更多的阳性患者获益。

3、然而基于ngs的现有技术定量的痛点在于ngs的现有技术均通过2轮pcr来建库，该方案会进一步放大扩增偏好从而导致肿瘤细胞定量不准，这是导致偏好和定量不准的首要原因；其次，通过单一的细胞参考品内参来定量存在较大的批次效应，通常在低丰度的肿瘤细胞时存在较大波动从而导致肿瘤细胞定量不准，并且不同的重排一级结构和长度对肿瘤细胞定量也有影响；最后，多重引物在体系中反应，每种igh重排型的扩增效率不一致从而导致肿瘤细胞定量不准，这一点在靶标优势克隆检测上尤为严重。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一轮pcr与连接法的技术体系结合特定组合的标准品库，进而提供了简便高效低成本的高通量检测流程。可降低两轮pcr导致的扩增偏好，以及通过特定组合的标准品库兼容实际样本中不同重排型的特征从而进一步降低定量的误差，最后通过含固定碱基结构的长分子标签，解决扩增偏好导致的肿瘤细胞定量失真的难题，拓展淋系白血病免疫组库定量检测的准确性，大幅降低了试剂与人力成本。

2、一方面，本发明提供一种用于矫正igh扩增偏好的标准品库，该标准品库包括五个标准品，其标准品名分别为vj118、vj311、vdj428、vdj510和vj741；其中，vj118包括序列seqid no：093，vj311包括序列seq id no：094，vdj428包括序列seq id no：095，vdj510包括序列seq id no：096，vj741包括序列seq id no：097。

3、进一步的技术方案中，所述标准品库涵盖了v1,v3,v4,v5的重排区域、扩增长度149bp-338bp、vdj重排与vj重排。

4、另一方面，本发明还提供用于矫正igh扩增偏好的试剂盒，该试剂盒包括序列seqid no：001- seq id no：090的引物组，序列seq id no：092固定碱基结构的长分子标签引物，以及序列seq id no：093-seq id no：097的标准品库混合物。

5、进一步的技术方案中，试剂盒还包括10×pcr buffer，dntp，amplitaq gold™ dna聚合酶，mgcl2，fea buffer v2，fea enzyme mix v2，t4连接缓冲液，t4连接酶和二代测序通用接头。

6、本发明中，特定组合的固定碱基结构的长分子标签涵盖了大于等于12个随机碱基，同时分子标签每4个碱基设计一个固定碱基用于矫正引物合成时候的gc偏好，并且该固定碱基设计需参照a>t>g>c的顺序进行设计，由于在随机碱基合成时存在合成错误及偏好导致多个相同的碱基串联如aaaaa、ggggg、ttttt等占比提升导致测序错误率显著升高从而分类错误，通过人为引入固定碱基可降低上述多个相同碱基串联，同时随机碱基序列合成过程存在偏好g碱基与c碱基的占比会偏高破坏平衡，因此固定碱基优先设计a与t。

7、本发明还提供一种基于本发明试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：

8、s1、对待测白血病样本的总dna进行提取并与序列seq id no：093-seq id no：097的标准品库混合物进行混合；

9、s2、利用含序列seq id no：001- seq id no：090引物组和序列seq id no：092的固定碱基结构的长分子标签引物对混合dna产物进行多重pcr扩增，得到经pcr扩增的dna；

10、s3、将经pcr扩增的dna进行接头连接、文库构建和二代测序，得到dna文库总量及测序数据；

11、s4、进行生信过滤分析，计算过滤扩增偏好导致的reads，同步基于已知拷贝数的特定组合的标准品库判定肿瘤细胞占比。

12、进一步的技术方案中，步骤s2中pcr反应条件为：步骤1：95℃，10min；步骤2：95℃，45sec；步骤3：60℃，45sec；步骤4：72℃，90sec；步骤2至步骤4循环35次；步骤5：72℃，7min；步骤6：4℃保持。

13、进一步的技术方案中，步骤s3中，接头连接为将所述经pcr扩增的dna进行二代通用接头连接，得到连接产物可直接测序。

14、进一步的技术方案中，步骤s4中，扩增偏好导致的reads计算包括如下过程：通过固定碱基结构的长分子标签引物序列计算相同的重排型去重前与去重后的reads，1减mi即为扩增dup，其计算公式为：

15、 ；

16、其中，去重后的reads记为xi，去重前的reads记为yi，不同重排型的扩增偏好矫正后占比记为mi，i代表上万种重排型个数。

17、进一步的技术方案中，步骤s4中，肿瘤细胞占比包括如下计算步骤：通过固定碱基结构的长分子标签引物序列与标准品库计算肿瘤细胞占比，已知每例样本投入量的纳克数为ck，每例样本的总细胞数e为：，其中，30ng的人基因组dna共10000个拷贝，先计算总拷贝数，拷贝数除以2为总的细胞数；特定组合的标准品库的拷贝数记为aj，特定组合的标准品库去重后的reads记为bj，上万种重排型去重后的reads记为xi，本样本中的肿瘤细胞数d为：，最后用本样本中的肿瘤细胞数除以本样本的总细胞数乘以100%后即为本样本中的肿瘤细胞占比mj：；最后计算标准品库中每个标准品的肿瘤细胞占比mj的平均值即为样本最终肿瘤细胞占比，其中k代表样本个数，j代表本次特定组合的标准品库个数，i代表检测到的上万种重排型个数。

18、本发明的有益效果：

19、鉴于现有淋系白血病免疫组库检测领域的三大缺陷：一是整体流程复杂，两轮扩增进一步放大偏好且导致患者使用成本高等问题；二是单一的细胞参考品内参来定量存在较大的批次效应，未考虑不同重排类型，扩增长度，针对于低于万分之一的肿瘤细胞定量存在50倍的波动；三是多重扩增效率不一致从而导致肿瘤细胞定量不准，现有的分子标签未考虑重排种类及合成偏好及错误，因此只能矫正不到40%的扩增重复（dup），扩增偏好仍超过100倍。本发明先从建库流程上去除二轮扩增降低扩增的偏好，再优化出扩增偏好去除的固定碱基结构的长分子标签，结合优化出肿瘤细胞准确定量的标准品库组合，最终保证了肿瘤细胞定量的准确性。本发明去重后的数据模型相对于去重前的数据模型偏好至少降低了75%的dup，扩增偏好只有2-10倍，相对于现有技术只能矫正不到40%的dup，扩增偏好仍超过100倍，性能上有显著提升。本发明去重后的标准品库数据模型显示在肿瘤细胞只有万分之一的情况下，不考虑复杂程度较高的重排型会有较大的定量波动，波动范围约有50倍，而本发明的标准品库数据模型综合考虑了复杂的分型可将肿瘤细胞定量稳定在2-3倍，结合上述固定碱基结构的长分子标签可将肿瘤细胞定量稳定在0.7-1倍左右。

20、本发明的方法以dna为检测样本与特定标准品库先混合后，用专属固定碱基结构的长分子标签引物组进行降落pcr靶向扩增，再通过标准化的纯化、文库构建、二代测序流程获取数据，最后用偏好矫正与肿瘤细胞定量计算方法处理数据，同步判定该样本中肿瘤细胞占比情况；并进一步明确该技术在淋系血液肿瘤中重排的检测及复发监测中的应用场景。

21、本发明不仅简化了实验流程，还具备检测性能优异、成本低廉及高通量的技术优势，可应用于淋系肿瘤免疫组库的检测，为多发性骨髓瘤、淋巴瘤、淋系白血病中igh重排突变的检测提供精准技术支撑。