一种动态突变的遗传病三核苷酸重复检测方法与流程

本发明涉及遗传病分子检测，具体为一种动态突变的遗传病三核苷酸重复检测方法。

背景技术：

1、动态突变类遗传病由特定基因中三核苷酸重复单元的异常扩增引起，重复次数测定结果的准确性直接关系正常型、前突变型和全突变型的区分。目前用于三核苷酸重复检测的常规技术包括聚合酶链式反应扩增后毛细管电泳、southern印迹杂交和sanger测序。聚合酶链式反应扩增后毛细管电泳通过产物片段长度间接推算重复次数，但三核苷酸重复片段的电泳迁移率除受长度影响外，还受碱基组成、二级结构和重复序列排布方式的干扰，长度相近而序列组成不同的片段在电泳谱中可能发生峰位重叠或偏移，难以仅靠片段长度确定重复区间的真实边界。southern印迹杂交能够检测较大的重复扩增，但操作过程繁琐，对片段长度差异的分辨能力有限，对低丰度样本和重复次数接近临界阈值的样本容易出现分型误差。sanger测序能够提供重复区域及侧翼序列的碱基信号，但重复序列的低复杂度特征容易引起聚合酶滑动、链终止反应不平衡和局部二级结构形成，使测序信号出现滑动峰、套峰和信号衰减，单一方向的测序峰图在重复区域经常无法可靠读出重复单元个数。在检测高gc含量重复序列、较长重复扩增或存在嵌合状态的样本时，上述方法对重复区段定位和重复次数读取的偏差更加明显。复杂电泳谱中与重复区段对应的波动范围未被有效分离时，进入后续测序的片段可能包含非重复区段，干扰计数结果；仅依赖单向测序信号时，重复区域内的碱基读取偏移无法由互补方向进行校正，连续重复区间的起止位置和长度难以稳定确定。动态突变遗传病三核苷酸重复检测中，需要减少复杂电泳谱中非重复区段对后续测序的干扰，并改善重复区域内单向测序信号滑动引起的计数偏差。

技术实现思路

1、针对动态突变遗传病三核苷酸重复检测中重复区间难以定位及重复次数计数易受测序信号滑动干扰的问题，提供一种动态突变的遗传病三核苷酸重复检测方法。该方法从非对称扩增产物的电泳迁移率偏移量构建碱基极性图谱，由重复单元内部碱基组成类型对应的极性偏移指数确定重复区间波动范围，对落入该范围的产物进行正向测序和反向测序，利用正反向测序信号峰图构建互补性偏离谱，根据连续偏离区间长度确定三核苷酸重复次数，并依据阈值关系判定待测样本的突变状态。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供一种动态突变的遗传病三核苷酸重复检测方法，包括：获取待测样本的双链dna，对所述双链dna进行非对称扩增，获得非对称扩增产物；根据所述非对称扩增产物的电泳迁移率偏移量，构建碱基极性图谱；根据所述碱基极性图谱中重复单元内部碱基组成类型对应的极性偏移指数，确定重复区间的波动范围；筛选所述波动范围内的所述非对称扩增产物，对筛选后的非对称扩增产物进行正向测序和反向测序，获得正向测序信号峰图和反向测序信号峰图；根据所述正向测序信号峰图和所述反向测序信号峰图，构建互补性偏离谱；根据所述互补性偏离谱中连续偏离区间长度，确定三核苷酸重复次数；根据所述三核苷酸重复次数与阈值的关系，判定待测样本的突变状态。该方法利用非对称扩增和电泳迁移率偏移特性获得碱基极性图谱，再结合正反向测序信号差异构建互补性偏离谱，能够可靠识别重复区间并准确计算三核苷酸重复次数。

3、作为本发明的一个技术方案，对所述双链dna进行非对称扩增时，设计正向引物和反向引物，所述正向引物的退火温度高于所述反向引物的退火温度；以所述双链dna为模板，采用所述正向引物和所述反向引物进行聚合酶链式反应；在聚合酶链式反应的循环过程中，控制退火温度从高温逐步降至低温，使所述正向引物优先结合模板链；在聚合酶链式反应的指数增长期结束后，继续增加延伸时间，使反向引物单链延伸产物过量累积，获得非对称扩增产物。通过退火温度差异和延伸时间控制，能够获得单链产物富集的非对称扩增产物，有利于提高后续迁移率分析的区分度。

4、优选的，根据所述非对称扩增产物的电泳迁移率偏移量构建碱基极性图谱时，对所述非对称扩增产物进行毛细管电泳分离，检测各片段在毛细管内的迁移时间，根据所述迁移时间计算迁移率；以迁移率基准值作为横坐标，以检测信号强度作为纵坐标，绘制所述非对称扩增产物的原始电泳谱图；根据所述原始电泳谱图中各信号峰对应的迁移率实测值，计算迁移率实测值与迁移率理论值的偏差，获得迁移率偏移量；根据所述迁移率偏移量的正负方向及偏移幅度，构建碱基极性图谱。该碱基极性图谱能够反映重复单元碱基组成变化引起的迁移率偏离，为重复区间识别提供基础。

5、优选的，根据所述碱基极性图谱中重复单元内部碱基组成类型对应的极性偏移指数确定重复区间的波动范围时，从所述碱基极性图谱中提取各重复单元的碱基组成类型，所述碱基组成类型包括三核苷酸重复单元的碱基序列排布方式；根据碱基组成类型中嘌呤碱基和嘧啶碱基的分布比例，计算所述重复单元的极性偏移指数；以连续若干个重复单元的极性偏移指数构成极性偏移序列，获取所述极性偏移序列的局部极值点；将所述极性偏移序列中相邻的局部极大值点和局部极小值点之间的数值跨度，确定为重复区间的波动范围。利用极性偏移指数的极值变化确定波动范围，能够更准确地划定重复区间边界。

6、优选的，筛选所述波动范围内的所述非对称扩增产物，对筛选后的非对称扩增产物进行正向测序和反向测序，获得正向测序信号峰图和反向测序信号峰图时，从所述非对称扩增产物中筛选出电泳迁移率偏移量落入所述波动范围内的扩增片段，作为待测序片段；将所述待测序片段分为第一组和第二组，对所述第一组采用正向引物进行测序反应，获得原始正向测序信号；对所述第二组采用反向引物进行测序反应，获得原始反向测序信号；将所述原始正向测序信号按碱基位置坐标排列，生成正向测序信号峰图；将所述原始反向测序信号按碱基位置坐标排列，生成反向测序信号峰图。通过限定测序片段范围并进行双向测序，能够减少非重复区域干扰，获得重复区域两侧的互补信号。

7、优选的，根据所述正向测序信号峰图和所述反向测序信号峰图构建互补性偏离谱时，将所述正向测序信号峰图中的各碱基位置与所述反向测序信号峰图中的各碱基位置进行碱基互补配对对齐，获得对齐后的碱基位置对应关系；提取对齐后的各碱基位置对应的正向信号强度值和反向信号强度值；计算同一碱基位置上所述正向信号强度值与所述反向信号强度值的强度差值；以所述碱基位置坐标为横轴，以所述强度差值为纵轴，绘制强度差值序列曲线，将所述强度差值序列曲线作为互补性偏离谱。互补性偏离谱突出正反向测序在重复区域的一致性偏差，能够提高重复次数计算的抗干扰能力。

8、优选的，根据所述互补性偏离谱中连续偏离区间长度确定三核苷酸重复次数时，遍历所述互补性偏离谱，按碱基位置顺序逐一判定各碱基位置对应的强度差值是否大于偏离阈值；将连续大于偏离阈值的碱基位置划分为一个偏离区间，记录每个偏离区间的起始碱基位置、终止碱基位置和区间长度；筛选出所有偏离区间中所述区间长度最大的偏离区间作为目标偏离区间；将所述目标偏离区间的区间长度除以三，获得三核苷酸重复次数。由此可以将偏离信号长度直接转换为三核苷酸重复次数，降低重复序列内部滑动导致的误差。

9、优选的，根据所述三核苷酸重复次数与阈值的关系判定待测样本的突变状态时，获取待测遗传病对应的正常重复次数上限阈值和致病重复次数下限阈值；若所述三核苷酸重复次数小于或等于所述正常重复次数上限阈值，则判定待测样本为正常型；若所述三核苷酸重复次数大于所述正常重复次数上限阈值且小于所述致病重复次数下限阈值，则判定待测样本为前突变型；若所述三核苷酸重复次数大于或等于所述致病重复次数下限阈值，则判定待测样本为全突变型。该分型方式与动态突变遗传病的临床阈值对应，能够直接给出样本突变状态。

10、作为本发明的一个技术方案，所述迁移率基准值为标准分子量标记物中各已知片段的理论迁移率拟合曲线值。采用标准分子量标记物拟合曲线作为基准，能够减少不同电泳批次间的系统偏差。

11、作为本发明的一个技术方案，所述极性偏移指数根据碱基组成类型中腺嘌呤和胸腺嘧啶的总含量与鸟嘌呤和胞嘧啶的总含量的比值计算获得。该指数能够量化重复单元的碱基极性差异，提高碱基极性图谱的分辨能力。

12、在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：

13、对双链dna进行非对称扩增，使目标单链产物过量累积，在毛细管电泳分离中依据各片段的迁移率实测值与迁移率理论值的偏差获得迁移率偏移量，并由偏移正负方向和偏移幅度构建碱基极性图谱。根据重复单元内部嘌呤碱基和嘧啶碱基的分布比例计算极性偏移指数，以连续重复单元的极性偏移指数形成序列并获取局部极大值和局部极小值，将相邻极值之间的数值跨度确定为重复区间波动范围。该方式通过序列组成依赖的迁移率偏移特征圈定重复区段，避免仅依靠片段长度判断重复区间时因长度相近片段重叠造成的边界误判，能够从复杂电泳谱中分离出与重复序列组成相对应的区段，减少非重复扩增片段进入后续测序步骤，使待测序片段更集中在三核苷酸重复区域。对筛选后的扩增片段分别进行正向测序和反向测序，将正向测序信号峰图和反向测序信号峰图中的碱基位置进行互补配对对齐，计算同一碱基位置上正向信号强度值与反向信号强度值的差值，并以碱基位置坐标为横轴、以强度差值为纵轴绘制互补性偏离谱。在互补性偏离谱中遍历各碱基位置，将连续大于偏离阈值的碱基位置划分为偏离区间，筛选区间长度最大的偏离区间作为目标偏离区间，再将目标偏离区间的区间长度除以三得到三核苷酸重复次数。该方式将正向和反向测序信号在同一碱基位置的强度差异转化为偏离区间，通过连续偏离区间长度反映三核苷酸重复的扩展范围，减弱了重复区域中单向测序信号滑动、峰型混乱和信号衰减对读数的影响，重复次数的确定不再单独依赖单一方向的峰间距或峰高，能够获得与正反向信号互补关系一致的重复次数计算结果。