饲料及食品中植物源性成分鉴定用引物组合物、试剂盒和方法

本发明涉及分子鉴定和测序，尤其涉及一种饲料及食品中植物源性成分鉴定用引物组合物、试剂盒和方法。

背景技术：

1、植物源性饲料是畜牧业的基础，其物种成分直接关系到饲料的营养价值、安全性以及成本。准确鉴定饲料中的植物物种成分，对保障饲料品质、实现精准营养投放、追溯污染或掺杂掺假来源（如违规添加廉价或有害植物成分）、以及满足法规监管要求具有至关重要的意义。

2、目前，对饲料中植物成分的鉴定主要依赖于以下技术：1、形态学鉴定：该方法主要依赖显微镜观察植物细胞形态、组织特征等。然而，对于经过粉碎、高温加工等处理的饲料产品，其植物组织结构已被破坏，形态特征消失或难以辨认，导致该方法失效或准确性极低。2、化学标记物检测：如近红外光谱、色谱技术等。这些方法间接反映样品的化学组成，但易受样品产地、加工工艺、储存条件等因素干扰，特异性不强，难以对复杂的植物物种进行精确区分，尤其难以应对未知物种的鉴定。3、基于dna的分子鉴定技术：该类方法基于物种独特的遗传信息，具有高特异性和灵敏度，是当前的发展方向。

3、基于dna的分子鉴定技术主要利用传统pcr扩增联合琼脂糖凝胶电泳技术，该方法通过特异性引物扩增目标dna片段，并通过电泳进行定性判断。尽管操作相对简单，但其分辨率极低，无法区分物种混合样品，只能确认特定物种是否存在，且灵敏度有限，易出现假阴性。更重要的是，它完全无法实现多物种成分的同步鉴定与定量分析，在复杂的饲料基质应用中价值有限。近年来，以纳米孔技术为代表的三代测序技术取得了长足进步，其独特的单分子实时测序原理，能够产生超长读长，并具备设备便携、实时读值、测序速度快等颠覆性优势。这为开发新一代的现场快速分子检测技术提供了可能。因此开发与纳米孔测序平台相匹配的快速、高效的样品前处理和数据分析方法，以真正发挥其“快速”和“现场化”的优势，建立针对饲料复杂植物成分的专用生物信息学分析流程和数据库，以实现高通量、自动化下的精准物种鉴定具有重要的现实意义和广泛的应用前景。

技术实现思路

1、本发明提供一种饲料及食品中植物源性成分鉴定用引物组合物、试剂盒和方法。

2、第一方面，本发明提供一种样本中植物源性成分的鉴定方法，包括：

3、s1、提取待测样本的基因组dna，以所述基因组dna为模板，使用第一引物和第二引物进行pcr扩增，得到扩增产物；所述第一引物是核苷酸序列为seq id no:1的单链dna分子，所述第二引物是核苷酸序列为seq id no:2的单链dna分子；

4、s2、根据所述扩增产物构建测序文库，并进行纳米孔测序，待获得至少200mb的数据后，停止测序，获得待测样本的测序结果；

5、s3、保留测序结果中测序质量q＞9且序列长度为500-650bp的序列，获得待测样本的序列信息；

6、s4、构建本地数据库，所述本地数据库包括植物标准品rbcl基因的序列信息；

7、s5、将所述待测样本的序列信息与植物标准品rbcl基因的序列信息进行比对，确定待测样本中植物源性成分的种类。

8、如上所述的方法，本发明中，所述植物源性植物是指来源于植物的成分，例如来源于植物的叶、茎、种子、根/块茎以及各类加工副产品。

9、如上所述的方法，本发明通过对多种植物叶绿体rbcl区域进行全局序列比对，设计出可以鉴别的扩增片段，同时设计出对应的正向扩增引物plant-f（即第一引物）和反向扩增引物plant-r（即第二引物）。seq id no:1具体为5-cyactggtacatggacaactg-3；seqid no:2具体为5-cygcagtagcattcaartaa-3，确保对多个植物物种均能得到扩增产物。

10、如上所述的方法，所述方法还包括：对两种或两种以上的待测样本中植物成分进行鉴定，在对每种待测样本基因组dna的扩增产物进行测序文库的构建中，在扩增产物的两端连接测序条形码序列，以区分不同的待测样本。所述条形码序列可以根据本领域常规技术手段进行设置。在一种具体实施方式中，所述条形码序列选自seq id no:13-22所示的序列中的至少一种。

11、如上所述的方法，由于纳米孔测序时会出现序列没有分离开，连续穿孔测序，多条短序列测成一条长序列的情况，因此，步骤3中需要根据目的条带的大小进行长度过滤，即选择序列长度为500-650bp的序列，获得待测样本的序列信息。

12、如上所述的方法，可以将所述植物标准品rbcl基因的序列信息构建本地数据库，方便将待测样本的序列与本地数据库进行比对。在一种具体实施方式中，所述本地数据库包括核苷酸序列为seq id no:3-12所示的序列。

13、如上所述的方法，当所述待测样本中包括两种或两种以上的植物源性成分时，所述方法还包括：根据比对结果，确定或辅助确定待测样本中两种或两种以上的植物源性成分的比例。进一步地，统计待测样本测序的总序列blast结果，根据某植物成分测序序列在总测序结果中的相对丰度推断待测样本中各植物源性成分含量的信息。

14、如上所述的方法，s5中，当待测样本的序列信息与植物标准品rbcl基因的序列信息的同一性不低于95%时，则确定待测样本中含有标准品对应的植物源性成分。

15、如上所述的方法，所述植物选自大豆、辣椒、豌豆、小麦、大麦、大米、向日葵、玉米、花生、油菜中的至少一种。

16、如上所述的方法，所述待测样本为饲料和/或食品。

17、第二方面，本发明提供一种引物组合物，包括第一引物和第二引物，所述第一引物是核苷酸序列为seq id no:1的单链dna分子，所述第二引物是核苷酸序列为seq id no:2的单链dna分子。

18、第三方面，本发明提供一种试剂盒，包括上述引物组合物。

19、第四方面，本发明提供上述引物组合物或者上述试剂盒在鉴定样本中植物源性成分中的应用。

20、第五方面，本发明提供一种植物成分鉴定数据库的构建方法，包括：

21、s1、提取植物成分的基因组dna，以所述基因组dna为模板，使用第一引物和第二引物进行pcr扩增，得到扩增产物；所述第一引物是核苷酸序列为seq id no:1的单链dna分子，所述第二引物是核苷酸序列为seq id no:2的单链dna分子；

22、s2、根据所述扩增产物构建测序文库，并进行纳米孔测序，待获得至少200mb的数据后，停止测序，获得待测样本的测序结果；

23、s3、保留测序结果中测序质量q＞9且序列长度为500-650bp的序列，构建得到植物成分鉴定数据库。

24、本发明提供了一种基于rbcl叶绿体序列的植物成分鉴定方法，结合三代纳米孔测序技术实现快速测序区分物种成分信息，适用于对样本中植物物种成分的快速鉴定。通过设计rbcl通用扩增引物序列，对待鉴定样本进行聚合酶链式反应（pcr）扩增。随后利用测序技术快速获得待鉴定样本的扩增产物的原始测序数据；预处理原始测序数据下机的fastq格式文件，保留长度在500-650bp且测序q＞9的符合扩增产物长度的高质量序列。基于建立的序列鉴定比对数据库，将得到的高质量序列进行查询分类，统计分类结果的信息，去除掉结果中的噪音，合并所有序列的查询结果，即可准确得到待鉴定饲料植物样品的成分信息，实现高通量、快速、准确地实现样本中植物成分的鉴别。